[发明专利]靶向RAF1抗乙脑病毒寡核苷酸的结构和用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种靶向RAF1蛋白激酶(RAF1，c-Raf，v-raf-leukemia viral oncogene 1)治疗流行性乙型脑炎病毒(简秤乙脑病毒，JEV)感染的反义寡核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、结构及其治疗药物。

背景技术

乙脑病毒在分类上属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)成员。流行性乙型脑炎(简称乙脑)国际上称为日本脑炎(Japanese encephalitis)。本病是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)经蚊虫媒介叮咬传播而引起的一种中枢神经系统感染的急性传染病，也是一种人兽共患的自然疫源性疾病。临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。病死率较高，而且后遗症严重，本病对人类健康危害较大。乙脑主要在亚洲以及东南亚热带和亚热带地区的一些国家流行，我国除少数省，自治区外，大部分地区都有乙脑流行。据统计，乙型脑炎病毒每年至少造成至少50000例临床病例，其中多数为十岁以下儿童，导致约10000人死亡，有15000人左右留有严重的永久性神经系统损伤。由于乙脑是一种人畜共患的自然疫源性疾病，在一般情况下乙脑病毒在蚊-猪-蚊中循环，一旦自然条件适宜，人群免疫力下降，就有可能发生人间乙脑流行或爆发，因此必须加强乙脑的预防与控制。但是目前临床上还没有针对乙脑的特异性治疗方法和特效的治疗药物，接种疫苗仍是唯一最重要的控制措施。目前用于免疫预防的灭活疫苗主要有鼠脑纯化灭活疫苗和地鼠肾细胞灭活疫苗，它们已广泛使用多年，对乙脑发病率的下降起到了非常重要的，但是副反应大，价格较高。活疫苗和减毒活疫苗的作用比灭活更有优势，但是国际上对该疫苗安全性和生产过程质量控制方面还没有认可，因此其安全性等方面还需积累更多资料。

因此，研究特异性高、毒副作用小的新型抗乙脑病毒感染的药物对治疗与预防病毒感染及其相关性疾病具有重要现实意义。

病毒是一种严格的细胞内寄生物。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系统及其二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会主动地通过对宿主细胞的生物大分子进行修饰，以使宿主细胞为它的复制、转录等提供必需的细胞机器。在短时间内不影响细胞存活且能为宿主细胞所能容忍的前提下，增强抗病毒信号或者阻断病毒复制所需的宿主细胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐药毒株产生的频率。

经研究已经证明，RAF1蛋白激酶作为重要的转录因子参与了细胞增殖与分化、凋亡、周期调控和细胞能量代谢等多个生物过程，而且该基因的抑制物有抗肿瘤作用已经得到广泛的研究。根据本发明，与人RAF1基因的mRNA互补结合的寡核苷酸能有效的抑制乙脑病毒并保护细胞使其免于乙脑病毒所致细胞病变，针对RAF1的反义寡核苷酸能特异性抑制乙脑病毒的感染复制。因此，设想其可能具有抗乙脑病毒感染的作用，从而对乙脑病毒感染相关疾病的治疗起到良好的效果。有可能成为治疗及预防乙脑病毒感染相关疾病的新型生物工程药物。

核酸药物是一类全新的基因靶向创新药物，长期以来一直是国际研究的热点，特别是近几年小核酸的发现进一步将核酸药物的研究推向一个前所未有的发展高潮。

反义寡核苷酸是一类经过人工合成的寡核苷酸片段，长度多为15～30个核苷酸。通过碱基互补的原理，干扰相关基因的转录和翻译，或者整个基因组的复制，其优点在于其理论上的高度靶特异性，是一种理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物。由于反义寡核苷酸作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗肿瘤和抗病毒新药。国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向RAF1阻断乙脑病毒复制、抑制这些病毒致病的寡核苷酸序列、结构及其药物。

本研究的内容是针对RAF1mRNA(NM_002880)，利用网上服务器Soligo设计了20条针对RAF1的反义寡核苷酸，从设计的这20个碱基长度的反义寡核苷酸序列中进行初步筛选。结果显示RAF1-19和RAF1-10抑制病毒所致细胞病变作用最佳。在BHK21细胞系中以RAF1-19为代表进一步评价了抑制乙脑病毒致CPE及抑制乙脑病毒复制的特异性、剂量依赖性。

表1反义寡核苷酸的分子设计