[发明专利]一种检测花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测花生过敏成分Arah1方法的建立，属于免疫分析技术领域。

背景技术

近年来，食物过敏已成为一个公众性的食品安全问题，而花生是最常见的八大食品过敏原之一。过敏疾病严重危害人们的身体健康，虽然激发过敏反应的最低过敏原的量随着人群的不同而不同，但是微量的过敏原就可以使绝大部分患者产生过敏症状。为了避免接触微量的过敏原，过敏原的检测成为当务之急。现在，虽然有许多过敏原检测方法可供借鉴，但在具体应用上都存在着各自不同的问题。体内实验方法可提供最为直接的证据，但由于安全因素等方面的考虑，只有在不得已的情况下在医院进行，而且费用昂贵、风险大；与此相比体外实验方法具有方便、安全点，但却存在着准确性差的缺点。目前体外微量的检测方法有免疫法、PCR法、组胺释放实验法、过敏原指纹快速检测法等。虽然目前有关过敏原检测的方法很多，但都存在各自不同的问题，如检测速度慢、成本高、需要特定的分析仪器等，这些制约了食品中过敏原检测方法的发展。因此实现准确、安全、经济、快速、高通量、高灵敏的体外检测技术方法具有现实意义。

双抗体夹心法是检测抗原的最常用方法，操作步骤如下：

1)将特异性抗体与固相载体联接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质；

2)加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗体抗原复合物。洗涤除去未结合的抗原物质；

3)加酶标抗体，保温反应。固相抗体抗原复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时，固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关；

4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。

发明内容

本发明的目的在于建立一种可以直接、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的双抗体夹心ELISA方法。用于检测花生过敏成分Arah1。

本发明所说的双抗体夹心ELISA检测花生过敏成分Arah1方法，是鼠抗花生过敏成分Arah1单克隆抗体作为一抗包被，与其配对成功的鼠抗花生过敏成分Arah1单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记后作为二抗，夹心法检测花生过敏成分Arah1。

本发明方法中所说的鼠抗花生过敏成分Arah1单克隆抗体，其制备方法是：杂交瘤的准备，筛选出针对花生过敏成分Arah1的强阳性细胞株14株用于免疫BALB/c小鼠，收集该免疫小鼠的腹水，进行脱脂纯化酶标，将此14株细胞株进行配对筛选，得到配对成功即两株能检测针对花生过敏成分Arah1的细胞株。

本发明方法的检测分析原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比（在本方法可检测范围内）。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量（OD值），即可确定待测抗原含量。

本发明的技术方案：一种花生过敏成分Arah1的双抗体夹心ELISA方法， 

（1）酶标板的制备：所用的包被原是鼠抗Arah1单克隆抗体，所用包被缓冲液是0.05 M、pH9.6碳酸钠缓冲液，所用封闭液是含0.1％明胶的上述包被缓冲液；

其中，鼠抗Arah1单克隆抗体是花生蛋白粗提取液免疫BALB/c小鼠制备；

（2）酶标二抗是辣根过氧化物酶标记与一抗配对成功的鼠抗Arah1单克隆抗体；

（3）洗涤液PBST的配方为：1000 mL蒸馏水中加入氯化钠8 g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9 g、氯化钾0.2 g、吐温-20  0.5mL。

（4）标准品稀释液的配方为：在含30%体积甲醇的pH 6.5的PBS中加入质量比为5%的氯化钠；

（5）显色液包括A液和B液，A液配方为每100 mL水中加入0.933 g柠檬酸，3.68 g Na₂HPO₄·12H₂O，18 μL 30%H₂O₂；B液配方为60 mg四甲基联苯胺溶于100 mL乙二醇，使用时按A︰B=1︰1体积比使用；

（6）终止液为2 mol/L的硫酸；

检测步骤为：