[发明专利]热启动DNA聚合酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种热启动DNA聚合酶及其应用，具体涉及含有两种DNA结合蛋白的热启动DNA聚合酶，属于生物技术领域。

背景技术

PCR已广泛应用于分子生物学各个领域，基本步骤包括，变性—退火---延伸。具体：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至引物退火温度，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在耐高温DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。经过几十个循环后就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

热启动PCR是提高扩增能力，扩增特异性，扩增灵敏度最好的一种方法。传统热启动PCR技术主要利用两种方法：抗体封闭法与化学封闭法。两种方法分别利用化学物质与抗体在常温下与DNA聚合酶活性中心结合以封闭酶活，在高温条件下化学物质或抗体失活，释放酶活，从而实现热启动。抗体封闭法是通过抗体特异性封闭酶活性中心，这种方法酶与抗体结合属于非化学键结合，在酶保存过程中，易出现抗体活性降低的风险，而且酶活性中心不是唯一，很难完全封闭酶活。化学封闭法，是通过化学物质与耐高温DNA聚合酶肽链上氨基形成稳定的酰胺键，在常温下可完全封闭酶活性，通过高温将酰胺键水解，释放酶活。这种方法需要长时间高温(至少15分钟)，水解酰胺键，长时间高温容易使DNA聚合酶活性降低；对于痕量模板，长时间高温易使模板降解。这两种方法并非实现热启动最理想的方法。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种热启动DNA聚合酶，该酶极大地提高了PCR反应特异性、灵敏度。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种热启动DNA聚合酶在热启动PCR反应中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案为：

本发明提供了一种热启动DNA聚合酶，该酶包括：

能够与引物结合的单链DNA结合蛋白；

能够与DNA模板结合的双链DNA结合蛋白；及

DNA聚合酶。

在本发明所述热启动DNA聚合酶中，两种结合蛋白与DNA序列的结合是非特异性结合。单链DNA结合蛋白与PCR体系中单链结构的引物结合，而双链DNA结合蛋白与双链结构的DNA模板相结合。结合蛋白后的引物与模板无法形成复合物，也不能与DNA聚合酶相结合，因此无法被DNA聚合酶所利用，从而避免产生非特异性扩增。随着反应的进行，两种结合蛋白质在预变性步骤受热失活，释放出引物、模板参与PCR反应，使PCR反应正常进行，实现热启动。

进一步地，本发明所述的“能够与引物结合的单链DNA结合蛋白”，“能够与DNA模板结合的双链DNA结合蛋白”可以是现有技术中已经报道的具有该功能的任何单链DNA结合蛋白或双链DNA结合蛋白，其可以通过购买或按照现有技术的方法进行制备而获得。

进一步地，所述单链DNA结合蛋白，双链DNA结合蛋白和DNA聚合酶的摩尔比为1-2∶1-2∶10-15。

为了详细说明本发明的技术效果，本发明在此提供了一种单链DNA结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，并提供一种双链DNA结合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，为了达到更好的技术效果，所述DNA聚合酶优选为Taq DNA聚合酶，可以通过购买或现有技术制备获得，例如Easy Taq DNA Polymerase(北京全式金生物技术有限公司)、TaKaRa Taq(宝生物工程大连有限公司)或Taq DNA Polymerase(天根生化科技有限公司)或所有从克隆有Thermu aquaticus DNA polymerase基因的大肠杆菌诱导表达后，经过蛋白纯化分离出的94KD的重组蛋白等。

本发明还提供了上述热启动DNA聚合酶在热启动PCR反应中的应用。