[发明专利]一种检测和评价抗病毒感染活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体工程和抗病毒医药领域，具体涉及一种快速有效的测定重组人抗乙型肝炎病毒抗体抗病毒功能的方法。

背景技术

人乙型肝炎病毒（human hepatitis B virus,HBV）感染是全球性的公共卫生问题，根据世界卫生组织（（World Health Organization，WHO）的统计，全球范围内有超过20亿人曾感染过HBV，其中，3.5亿正遭受慢性HBV感染之苦（WHO,2000）。我国为乙型肝炎的高发区。2006年全国病毒性肝炎血清流行病学调查数据显示，在全部人群中乙肝表面抗原（HBsAg）的阳性率为7.18%。据此估计我国有9300万人为HBV携带者，其中，3000万例为慢性乙型肝炎患者。研究还显示，慢性的HBV感染又与肝硬化和肝癌的发病率和死亡率密切相关。

乙肝病毒是DNA病毒，具部分环状双链的DNA。基因组长度约为3.2kb，含有四个基本阅读框架，分别是编码核心蛋白（核心抗原）和e蛋白（e抗原）的C基因；编码大、中和小表面蛋白（表面抗原）的S基因；编码聚合酶的P基因和编码X蛋白的X基因。人乙型肝炎病毒具有种群和组织特异性，只感染人类的肝细胞。

乙肝病毒的感染始于病毒附着在肝细胞上，通过未知的机制，病毒外膜与细胞膜发生融合，病毒核衣壳被释放到细胞质中并解聚，病毒基因组转移到被感染细胞的细胞核内，在细胞修复酶的作用下形成闭合环状DNA（cccDNA）。随后，病毒以cccDNA为模板转录产生四种mRNA，分别是3.5kb的pgRNA、2.4kb的mRNA、2.1kb的mRNA和0.8kb的mRNA。2.4kb和2.1kb的mRNA指导表面蛋白的翻译；0.8kb的mRNA指导X蛋白的翻译；而3.5kb的pgRNA除了指导核心蛋白和聚合酶的翻译外，还作为病毒的前基因组RNA，被新产生的核心蛋白和聚合酶包裹，形成新的核衣壳。在核衣壳中，病毒聚合酶以pgRNA为模板通过反转录合成新的DNA基因组。最终，完成DNA复制的核衣壳被表面蛋白包裹，形成成熟的病毒粒子，分泌出细胞，开始新的感染周期。

在HBV感染者的血清中可见三种不同形态的病毒颗粒，即大球型颗粒（又称为Dane颗粒）、小球形颗粒和管型颗粒。虽然这三种形式的颗粒都具有乙型肝炎表面抗原（HBsAg），但是只有大球型颗粒内部含病毒的双链DNA分子，并具感染性。同时值得注意的是，小球形颗粒，也称亚病毒颗粒，一般在血液中可比Dane颗粒多出10，000至1，000，000倍。部分病人自然感染状态下会出现保护性抗体。研究表明，乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的主要抗原为“a”决定簇。免疫显性“a”表位在所有病毒血清中存在。治疗慢性病毒感染的抗体都是抗HBsAg。

人抗乙肝病毒抗体（HBIG）系从乙型肝炎疫苗免疫健康人群中，采集高效价血浆或血清后，分离提取制备的免疫球蛋白制剂，在临床上被用于降低HBV的感染率。在中国和其它HBV高发地区，母婴传播是HBV的主要的感染途径之一。临床研究显示，HBIG与重组HBV疫苗联合使用是目前阻断HBV母婴传递最有效的手段，其保护率达95%左右。乙肝表面抗原(HBsAg)阳性母亲所产新生儿出生后24h内使用乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白(HBIG)，已在《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》中被建议。器官移植后乙肝病毒感染是影响手术成功率的主要因素。高剂量的HBIG抑制肝脏移植后HBV再感染率的成功率达60%至85%。临床研究表明，围产期的母婴传播率与母体病毒载量高度相关，肝脏移植后HBV再感染的风险也与病毒载量直接相关。HBIG的使用可能降低病毒的载量。

由于HBIG的生产和临床应用分别存在着血源稀缺和血源性传播疾病感染等隐忧,重组型人抗乙肝单抗（mAb）已受到了医药产业界的关注。值得注意的是，虽然治疗性单抗药物（mAbs）在过去的20年里已悄然成为推动生物医药产业发展的主力，但是单抗技术在感染性疾病领域的应用相对滞后，目前只有一个抗-呼吸道合胞病毒的单抗药物用于临床。Shlomo Dagan等人在2001年报导了两个抗HBV人单抗的联合用药的一期临床试验结果后，有关抗HBV单抗的研究进展缓慢，其中的一个重要原因，就是缺乏评估重组人抗乙肝单抗（mAb）中和病毒能力的评估系统。