[发明专利]蚕豆蛋白水解物中的乳酸菌促生长肽的制备方法

权利要求书

1.一种蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其组成包括：(1)蚕豆分离蛋白的制备：料液比为1∶12，提取pH8.0，超声提取的功率660W，提取时间为20min，蚕豆分离蛋白中蛋白质含量为89.32％；(2)蚕豆蛋白水解物的制备：按底物浓度6％-8％加入蒸馏水中混匀，70-90℃下热处理蚕豆分离蛋白10-15min，按照酶与底物比为84000-96000U/g加入碱性蛋白酶，通过加入2M氢氧化钠来保持pH8.5不变，反应温度为50-70℃，反应时间1h，水解度达到15-18％；(3)水解后的蚕豆蛋白水解物进行冷冻干燥，将干燥粉溶解在双蒸水中，制备成不同浓度的水溶液用于测定蚕豆蛋白水解物对保加利亚乳杆菌等乳酸菌生长的促进作用；(4)蚕豆蛋白水解物采用葡聚糖凝胶Sephadex G-25进行分离纯化，收集流出液并积累浓缩，得到促生长活性最高的组分；(5)再通过高效液相色谱法分离纯化，得到单一的促生长活性组分。利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS进行分子量分析。

2.根据权利要求1所述的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其特征是：所述的葡聚糖凝胶层析分离条件为：葡聚糖凝胶层析柱：Sephadex G-25；洗脱液：双蒸水；流速：0.3-0.5mL/min；上样量：1-2mL；紫外检测：280nm。

3.根据权利要求1或2所述的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其特征是：所述高效液相色谱HPLC分离纯化条件如下：色谱柱：4.6×250mm，C₁₈反相柱；流动相：含1-5％乙腈的水溶液；流速：0.8-1mL/min；梯度：等度洗脱；紫外检测：280nm。根据洗脱峰的保留时间，手动收集样品，然后进行浓缩。

4.根据权利1或2或3所述的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其特性是：所述的测定蚕豆蛋白水解物或分离纯化后组分对乳酸菌(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等)生长的促进作用试验方法如下：

a.所用菌种为实验室保存的乳酸菌，所用培养基为MRS培养基和脱脂乳培养基。

b.将保加利亚乳杆菌等按3-5％接种量接种于含有不同浓度的蚕豆蛋白水解物的MRS液体培养基中，37℃培养20h，在660nm下测量发酵液的OD值，检测对乳酸菌生长的促进作用；

c.按照b所述方法对分离纯化后的蚕豆肽组分依据≥2g/L的浓度添加到MRS液体培养基中，37℃培养20h，取出发酵液，在660nm下测量OD值，检测对保加利亚乳杆菌生长的促进作用。