[发明专利]房颤易感基因无创检测试剂盒

说明书

技术领域

本专利属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种房颤易感基因无创检测试剂盒，通过检测房颤易感性密切相关的基因，从基因层面评估房颤遗传易感性的风险级别，为房颤的预防提供建议指导。

背景技术

心房颤动（atrial fibrillation，AF，简称房颤）是一种以心房快速而不规则激动为特征的心律失常，在临床上也是持续性心律失常中最为常见的一种，它不但使患者频繁心悸，而且心房的不规则颤动易产生左心房血栓，导致多种并发症，重者危及生命。

房颤的患病率随着年龄增长而显著增加。我国目前房颤患者约有1000万人，成人房颤的发病率为0.77％，80岁以上人群中上升至7.5%，与国外调查结果类似，上海和山东威海等地区的房颤流行病学调查也显示了相似的患病趋势。

单核苷酸多态性（SNP）是人类基因组DNA序列变异的主要形式，是决定人类疾病易感性和药物反应性个体差异的重要因素。现有的研究已经明确了一些房颤家系的致病基因和位点以及一些基因多态性位点与房颤的相关性。

血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）基因由5个外显子和4个内含子构成，第2外显子上第704位核苷酸T-C突变导致第235位氨基酸由甲硫氨酸变成苏氨酸。这个突变可引起血浆中AGT水平轻度增加，促使血管紧张素Ang I和Ang II增加，进而改变血管收缩、水盐代谢和醛固酮合成，导致心房纤维化及传导不均一性等，这对房颤的潜在诊断和预测疾病的发生、发展具有重要的应用价值。

G蛋白是由α、β、γ三个亚基组成的异源三聚体，介导G蛋白偶联受体激动后的细胞内信号转导，参与细胞多种生命过程。其中编码G蛋白β3亚基的GNB3基因第10个外显子存在一个多态位点C825T，T等位基因的出现导致β3基因第9外显子在转录时缺失123个碱基，由此产生了活性更强的GNB3剪辑变异体，导致下游的信号活动增强，这种作用在中国人群中增加了房颤发生的风险，显示了GNB3 C825T是家族性房颤的一个遗传危险因素。

转化生长因子β1（Transforming growth factor beta1, TGF-β1）在心房纤维化的发生和调控方面有非常重要的作用，该基因的T869C位点多态性与房颤的发生有较高相关性。这种基因多态性能引起编码区第10密码子亮氨酸（Leu）替换为脯氨酸（Pro），影响蛋白的疏水性，导致TGF-β1蛋白输出改变，引起心房纤维化，为房颤的发生提供病理基础。张忠栋等2009年对103例房颤患者和109例对照者的研究显示，T869C位点SNP与中国华南地区汉族人群房颤的发生有明显的相关性，T等位基因是房颤发生的保护基因，C等位基因是房颤的易患基因。      

单核苷酸多态性已成为人类群体遗传学的生物学标志，因此，建立简单、快速的房颤易感基因无创检测方法，能够检测出与房颤发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患房颤的高危人群，及早进行预防，对降低房颤发病率、减轻社会经济负担有着重要意义。

发明内容

基于AGT基因上M235T (rs699)、GNB3基因上C825T(rs5443)、TGF-Β1基因上T869C (rs1982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估房颤发病风险级别，本发明提供一种房颤基因无创检测试剂盒。

该试剂盒包括：

检测AGT基因上M235T (rs699)、GNB3基因上C825T(rs5443)、TGF-Β1基因上T869C (rs1982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；

PCR反应组件（包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH2O等）；

PCR产物纯化组件（包括SAP酶、ExoI酶、ddH2O等）；

DNA测序反应组件（包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH2O等）。

本发明试剂盒的组分和含量包括：

PCR反应体系：10×PCR反应缓冲液 2.5ul；25mM dNTP混合液0.2ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul；20uM特异性引物对（每条引物各0.25ul）；ddH2O 19.175ul；

PCR产物纯化体系：1U/ul SAP酶 0.75ul；10U/ul ExoI酶0.375ul；ddH2O 3.875ul；