[发明专利]用于检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于环境生物学领域，尤其涉及一种检测链霉菌two-domain漆酶基因的引物及其检测方法。

背景技术

漆酶是一类含铜的多酚氧化酶 （p-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2），属于蓝色多铜氧化酶家族。漆酶一直是生物工程、化学工程、酶工程、材料科学和环境科学等领域十分活跃的研究热点，漆酶作用底物相当广泛，能够对多种酚类污染物显示出较强的催化降解能力，因此漆酶在酚类污染物的处理和生物传感器的构建等方面显示出良好的应用前景。

漆酶具有氧化木质素的能力，可参与木质素的降解或聚合，是参与木质素降解或解聚的三大酶系之一。漆酶的结构决定了漆酶的特性，因而也就决定了漆酶氧化降解木质素的能力。根据漆酶来源的不同可将其分为漆树漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶三大类，而不同来源的漆酶氧化降解木质素的能力相差很大。与真菌漆酶相比，细菌漆酶有更多的优点，如不需糖基化、热稳定性好及酶活性的最适pH值范围广等。

降解木质素的细菌种类很多，放线菌是公认的降解能力较强的一类丝状细菌，包括链霉菌(Streptomyces)、节杆菌(Arthrobacter)、小单胞菌(Micromonospora)和诺卡氏菌(Nocardia)等。由于放线菌可以穿透木质纤维素等不溶基质，因此在中性、微碱性土壤或堆肥中，放线菌参与有机质的初始降解和腐殖化。国外学者对放线菌中的链霉菌进行了研究，发现该菌菌丝分枝多且产量大，在高斯培养基上菌落质地紧密，与培养基结合牢固不易挑起。在初级代谢阶段，该菌有降解木质素的能力，其主要是通过脱甲基、芳环断裂和侧链氧化三种途径降解木质素。有研究曾表明，链霉菌在堆肥和土壤放线菌中占有很大的比重，为堆肥放线菌群落中的优势种群；尤其在堆肥高温期，真菌等中温菌的数量减少，由于链霉菌耐高温及弱碱性环境，在堆肥高温期链霉菌大量繁殖生长，成为堆肥高温期间的优势种群，其在高温阶段产生抗生素抑制致病菌，同时产生木质纤维素胞外酶分解木质纤维素，并在较长时间维持分解半纤维素。因此，链霉菌在木质纤维素含量丰富的农业固体废物堆肥中为降解木质纤维素等难降解有机质发挥了重要的作用。

目前的研究主要着重于传统three-domain漆酶基因的结构以及作用机理，对于two-domain漆酶基因及其木质素降解结合机理研究比较少，现在还是属于一个相对空白的研究区域。Two-domain漆酶是比传统的three-domain漆酶氨基酸残基少、分子量小的一类漆酶。Two-domain漆酶是被广泛认为存在于链霉菌中的一类新型漆酶，Streptomyces griseus、Streptomyces ipomoeae、Streptomyces coelicolor、Streptomyces scabiei等链霉菌中都发现了具有two-domain的laccase-like漆酶氨基酸。链霉菌two-domain漆酶具有比一般漆酶热稳定性更高、酶的最适宜的pH范围更广等优点。因此，链霉菌属two-domain漆酶基因的研究对于链霉菌属two-domain漆酶应用的环境条件和应用领域的扩展及其分子生物学研究具有十分重要的意义。另外据我们了解，近年来针对漆酶基因多样性的研究均主要着重于传统three-domain担子真菌，子囊菌以及细菌漆酶基因。对于检验某一类漆酶基因的特异性引物，主要有担子真菌漆酶引物Cu1F/Cu2R（多铜结合一区以及多铜结合二区设计）、子囊菌漆酶基因特异引物LAC2F/LAC3R（多铜结合二区以及多铜结合三区设计）以及细菌漆酶特异性Cu1AF/Cu2R（多铜结合一区以及多铜结合二区设计）。以上漆酶基因的特异性引物都是针对于传统的three-domain漆酶基因所设计的，对于检验链霉菌two-domain漆酶基因的特异性引物，现有文献中未见有相关报道。链霉菌two-domain漆酶与传统的three-domain的漆酶相比，缺少第二个结合域，氨基酸残基少，分子量小，但仍然含有四个铜的结合位点。链霉菌two-domain漆酶在多铜结合位点的保守区域氨基酸与传统的漆酶相比有很大的差异，因此，对于如何设计出能有效检测链霉菌two-domain漆酶基因的简并引物，并无先例可循，但该简并引物的开发对于在环境中检测以及得到未知的链霉菌two-domain漆酶基因、进而掌握链霉菌的生物作用机理，又具有十分重要的意义。

发明内容