[发明专利]检测结核杆菌药敏性的方法及培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测结核杆菌药敏性的方法和培养基，尤其涉及一种可以不加入显色剂即可观察结核杆菌药敏性的方法和培养基。

背景技术

结核杆菌（MTB）是高致死率的传染病，自上世纪80年代以来，全球结核病疫情出现了急剧恶化，其中重要原因之一是结核杆菌耐药性，耐药性已成为治疗和控制结核病的巨大障碍，因此，检测结核杆菌药物敏感性对于控制疫情、治疗疾病、药物筛选和研发等均极为重要。

WHO推荐的比例法稳定性较好，但是需要4周时间，无法为临床提供及时的用药参考；BACTEC 3D方法可在一周内报告结果，但是该方法采用放射性元素，价格昂贵。

张文宏等（《微生物与感染》，2008，3(4)：p204）报道了试验三磷酸腺苷发光法快速检测结核分枝杆菌药敏性，5~7天后检测敏感菌释放的ATP，从而判定MTB对药物的敏感性；彭丽等（《中国防痨杂质》，2005，27(1)：p18）报道了以分支杆菌噬菌体为基础的噬菌体生物扩增法，利用噬菌体生长快、只能活在分支杆菌中增殖的特性，可大大缩短检测时间；此外还报道耐药性基因测定，如PCR-单链构象多态性分析、DNA测序、DNA芯片检测等；虽然上述方法应用前景较好，但是上述对操作条件和操作人员技能要求较高，不利于工业上使用。

2000年，Caviedes等人建立了一种新的MTB耐药性检测技术——显微镜观察药物敏感度检测技术（MODS），通过倒置显微镜对MTB特征性索状结果进行观察，来确定MTB的生长，从而进行药敏判断，胡忠义、崔振玲等（《中华预防医学杂志》2011，45(1)：p21）进行了MTB痰涂阳标本直接药敏实验，证明MODS技术直接检测痰涂阳标本中MTB对药物的敏感度具有快速、准确、廉价的优点，可作为痰涂阳标本直接药敏检测方法。

在MODS方法中，将MTB与药物一起与培养基混合，然后进行培养，所用培养基主要为固体培养基和液体培养基、以及在此基础上的固液双相培养基、半流体培养基等，其中液体培养基能够使MTB广发接触营养成分，因此MTB生长较快，但是液体培养基不利于肉眼观察，一般需要加入显色剂染色，以判断结核杆菌是否生长，而显色剂往往会给MTB带来毒性，因此影响药敏性的判断。

发明内容

针对目前液体培养基、以及检测结核杆菌药敏性方法不便于直接肉眼观察的问题，本发明提供了一种新的检测结核杆菌药敏性的方法和培养基。

本发明第一个方面是提供一种检测结核杆菌药敏性的培养基，包括液体培养基、促生长组分，所述培养基为酸性，pH值≥4.5。

所述培养基pH值优选为4.5~6.5，更优选为5~6。

其中，所述液体培养基可以是单独的液体培养基，也可以是来自含有液体培养基的固液双相培养基、或包括所述液体培养基的混合物。

所述液体培养基如米氏培养基、苏通培养基、以及其它可用液体培养基、或上述培养基的改良，可以是其中的任意一种或多种的混合，并优选为米氏培养基7H9、7H10、7H11、或上述任意培养基的改良、或其中任意几种的组合，更优选为米氏培养基7H9、7H10、或上述任意培养基的改良、或其混合物；最有选为米氏培养基7H9、7H10、或其混合物。

所述促生长组分指的是促进结核杆菌生长的营养组分，如牛血清蛋白、小牛血清、酵母提取物、葡萄糖（右旋糖）、氯化钠、硫酸镁、氯化锰、油酸、过氧化氢酶（Catalase）等，可以是其中的任意一种或几种的混合物。

根据本发明所述培养基的一种实施例，所述液体培养基包括米氏培养基，以及用于调节pH值的酸，此外，还可以包括蛋白胨、酵母提取物、琼脂、甘油、乳化剂中的任意一种或几种的混合物；所述酸可以是有机酸或无机酸，并优选为无机酸，如磷酸、盐酸、磷酸氢盐、磷酸二氢盐等，可以是其中的任意一种或几种的混合物，所述盐优选为钾盐、钠盐、或其混合物。

所述蛋白胨可以是来自于动物或植物，如牛肉蛋白胨、鱼蛋白胨、大豆蛋白胨等，具体例子包括酪蛋白胨、骨蛋白胨、胰蛋白胨等。

所述乳化剂可以是脂肪酸环氧乙烯酯、多元醇脂肪酸酯、多元醇脂肪酸酯与环氧乙烷缩合物等，如吐温-20、吐温-21、吐温-40、吐温-60、吐温-21、吐温-80、吐温-81、吐温-85等，可以是一种或多种的混合物。

根据所述培养基的另一种优选实施例，所述培养基还包括抗生素，以抑制其它菌的生长，可以是单一抗生素或多种抗生素的混合物，如多粘菌素B、两性菌素B、萘啶酸、甲氧苄嘧啶、氨苄西林等。

本发明的第二个方面是提供一种检测结核杆菌药敏性的方法，步骤包括：