[发明专利]一种阿魏酸酯酶基因(Fae-A)的克隆及重组酶的制备

权利要求书

1.一种来源于Aspergillus usamii E001的新型A类阿魏酸酯酶，其核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

2.A.usamii E001新型A类阿魏酸酯酶基因序列克隆及表达的方法：

(1)从已报道的Aspergillus niger CBS 513.88基因组信息中找出编码黑曲霉A类阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后对该序列进行开放读码框分析和信号肽预测，根据预测的结果设计一对特异性引物，引物序列如下：

FAE-F：5’GAATTCGCTTCCACGCAAGGCATCTC3’

FAE-R：5’GCGGCCGCTTACCAAGTACAAGCTCCG3’

提取A.usamii E001的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增；将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-Fae-A)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus Fae-A成熟肽cDNA序列；

(2)将测序结果正确的pUCm-T-Fae-A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Fae-A(图1)，并对重组质粒进行序列测定；

(3)GS115/Fae-A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sac I对pPIC9K-Fae-A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Fae-A；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用紫外吸收法测定重组阿魏酸酯酶活性。