[发明专利]一种新型检测个体化胰岛素的免疫质谱试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种非侵入性检测、评估胰腺癌伴有重型糖尿病病人试剂盒的新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被磁珠或抗体捕获的胰岛素进行精确地鉴别、检测。

背景技术

随着人类基因组计划的实施和完成，科学家们提出了后基因组(post-genome)计划的概念，研究要点转移到功能基因组学上，而生物功能主要体现物质是蛋白质。1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋白质组(proteome)的概念，指的是“一种基因组所表达的全部蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。对于蛋白质组的研究是功能基因组学研究的核心，称为蛋白质组学(proteomics)。蛋白质组学被认为是后基因组研究中最主要的部分。与基因组相比，蛋白质组的组成更复杂，功能更活跃，应用前景更广泛。蛋白质组学从细胞整体水平进行蛋白质属性的研究，如表达水平、翻译后修饰及相互作用等，并由此获得对于疾病过程、细胞生理生化特征和调控网络的广泛完整的认识。所以，蛋白质组学技术正在逐步成为生物学、医学及制药学等的重要研究手段。

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。用抗体及质谱联合可克服这一技术缺点。

发明内容：

本发明的目的是建立一种在生物样品中检测变异的胰岛素的免疫质谱试剂盒和制备方法。该方法为疾病的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的变异的或修饰的生物标志提供了基础。

本发明涉及一种非侵入性检测的新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被抗胰岛素抗体捕获的变异的胰岛素进行精确地鉴别、检测的方法。

变异的胰岛素的免疫质谱试剂盒制备及检测方法：

一小管标有抗胰岛素抗体的磁珠，50微升；

一小管结合缓冲液(磷酸盐缓冲液，PBS buffer，pH 7.0-8.0)，500微升；

一小管洗涤液(去离子水)，500微升；

一小管洗脱液(1-2％三氟乙酸)，50微升；

一小管以50％乙腈、0.5％三氟乙酸的制备的吸能分子标准溶液，50微升。

上述各小管置于4℃冷藏盒中。

具体操作步骤如下：(1)将生物样品稀释在结合缓冲液中；用O型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清；所述步骤(2)将质谱的标准化质控血清及样品点样在已标记上抗胰岛素抗体的基质上，常用与抗体结合的基质可选择Protein A、Protein G、或streptavidin-biotin系统；基质的支持物用陶瓷珠、磁性珠、多聚体或Sepharose beads；所述基质的支持物采用陶瓷珠、磁性珠、多聚体或Sepharose beads之中的任一种；所述步骤(3)用洗涤液洗涤；在样品完全干燥前将第一份洗涤液加到该位点；洗涤液在位点上至少停留10秒；彻底清除第一份洗涤液，用第二份洗涤液重复以上步骤；用1～2％三氟乙酸洗脱液彻底洗涤磁珠，将生物标志洗脱至质谱专用的金属片上，自然干燥金属片，加0.5μL以50％乙腈、0.5％三氟乙酸制备的吸能分子标准溶液；吸能分子用sinapinic acid或alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid；所述步骤(4)用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用波长337nm的氮激光仪和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析变异的胰岛素；用仪器的软件进行定量性质谱自动调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091.1Da或6634.0Da强度调至质谱仪信号强度最大值的50％。用计算机分析数据进行数据重叠展示5807.65Da或5835.65Da生物标志。

本发明中变异的胰岛素是利用一台高精确度的质谱仪来发现的；该设备的质量精确度约为0.001％。