[发明专利]无选择标记残留的乳酸菌基因组基因操作系统及其应用

权利要求书

1.一种无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于包括一个辅助质粒、一个用于构建基因打靶主质粒的中间质粒和一个作为基因操作基础的乳酸菌菌株，

其中所述辅助质粒含有一个宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因和一个温度敏感型及宽宿主范围穿梭型完整的pWV01复制子；

其中所述用于构建基因打靶主质粒的中间质粒含有一个宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因、一个温度敏感型及宽宿主范围穿梭型完整的pWV01复制子和一个表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因（upp）的宽宿主范围穿梭型表达盒；

其中所述的乳酸菌菌株为缺失尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的任意乳酸菌菌株。

2.如权利要求1所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述辅助质粒依次含有大肠杆菌—革兰氏阳性细菌宽宿主范围表达的穿梭型红霉素抗性基因Emr、温度敏感型及大肠杆菌—革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的pWV01复制子。

3.如权利要求1所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述用于构建基因打靶主质粒的中间质粒依次含有大肠杆菌—革兰氏阳性细菌宽宿主范围表达的穿梭型氯霉素抗性基因Cmr、一个温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整pWV01复制子、一个表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的宽宿主范围表达盒p32upp。

4.如权利要求1所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述的乳酸菌菌株为缺失尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的完整开放阅读框，但保留了upp基因的原始启动子和终止子的乳酸菌菌株。

5.如权利要求2所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述的辅助质粒中，大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因Emr依次由ermC启动子、ermC基因、ermC终止子构成，优选的所述的大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型红霉素抗性基因Emr为962bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的pWV01复制子依次由单链复制起始位点、双链复制起始位点、ORF B基因、ORF C基因、RepA基因、ORF D基因构成，优选的所述的温度敏感型及大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的pWV01复制子为1751bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.如权利要求5所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于所述的辅助质粒为pGBHE，其完整核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.如权利要求3所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于在所述的中间质粒中，大肠杆菌—革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因Cmr依次由ermC启动子、Cmr基因、ermC终止子构成，优选的所述的大肠杆菌—革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型氯霉素抗性基因Cmr为896bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；温度敏感型及大肠杆菌—革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的pWV01复制子依次由单链复制起始位点、双链复制起始位点、ORFB基因、ORF C基因、RepA基因、ORF D基因构成，优选的所述的温度敏感型及大肠杆菌—革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭型完整的pWV01复制子为1751bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；表达尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因的宽宿主范围p32upp表达盒，依次由p32-启动子、upp基因、prt-终止子构成，在p32upp表达盒的上游依次含有三个乳酸菌的极稀有限制性内切酶位点Asc Ⅰ（GGCGCGCC）、Pac Ⅰ（TTAATTAA）、Not Ⅰ（GCGGCCGC），优选的所述的p32upp表达盒为1086bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.如权利要求7所述的无选择标记残留的乳酸菌基因组修饰操作系统，其特征在于在所述的中间质粒为pGBHC32upp，该质粒的完整核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。