[发明专利]加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种发酵培养方法，具体涉及加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液的制备方法。 

背景技术

随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们越来越关注环境污染，生态平衡和人类健康等问题。尤其是对食品品质要求也越来越高。无公害蔬菜和绿色食品，已经得到全社会的公认。开发和利用生物农药，开展生物防治，势在必行。当前，微生物农药在开展生物防治中将大显身手。因为它具有明显优点:对环境安全，无公害，无残留，不易产生抗性，生产成本低，发酵工艺简单，对非靶标生物安全。 

作为微生物农药来源之一的植物内生真菌(Endophytic fungi)在宿主植物长期相互作用、协同进化、互相适应过程中，在植物体内维持了微生态系统平衡。同时，为了保持这种平衡，植物内生真菌可能产生与其周边环境（即宿主植物）相似或相同作用的次生代谢产物。因此，可以认为植物内生真菌的次生代谢产物可以替代宿主植物的代谢产物，进而作为新化合物、新药物筛选的潜在或替代资源，从而可以有效降低新药物或其它用途活性物质的研发成本。 

加拿大一枝黄花（Solidgo canadensis）作为一种外来物种，繁殖力极强，传播速度快，生长优势明显，生态适应性广阔，与周围植物争阳光、争肥料，直至其它植物死亡，从而对生物多样性构成严重威胁。加拿大一枝黄花可做观赏切花、饲料、蜜源，同时可用于天然色素的生产和提炼精油。目前, 已经发现加拿大一枝黄花体内具有较强的抗氧化、自由基消除活性和多种抑菌活性的黄酮类成分。此外还有报道加拿大一枝黄花的植物浸提液对许多杂草（如光头稗和大狗尾草）及多种蔬菜（紫花苜蓿、红苋菜、小麦、大豆和棉花 ）的种子萌发及幼苗生长具有显著的化感作用。根据植物内生真菌内共生理论，加拿大一枝黄花很有可能存在着特殊的内生真菌，通过产生特殊的具有抗菌活性的次生代谢产物。目前，国内外还没有加拿大一枝黄花内生真菌次生代谢产物对植物病原菌抑菌活性的研究报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有较强的抑制植物病原真菌活性的加拿大一枝黄花内生真菌抗菌发酵液的制备方法。 

本发明所述的加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳菌yt03（Chaetomium globosum yt03），现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市北辰西路1号院3号，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088。 

本发明所描述的加拿大一枝黄花内生真菌系从中国安徽省合肥市加拿大一枝黄花 (Solidgo canadensis)植物活体中分离得到的。 

加拿大一枝黄花内生真菌命名为球毛壳菌yt03（Chaetomium globosum yt03），保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期2011年7月20日，保藏编号为CGMCC No.5088； 

本发明加拿大一枝黄花内生真菌抗菌发酵液的具体发酵制备操作步骤如下：

（1）菌种活化

     在无菌条件下，用接种环挑取少许加拿大一枝黄花内生真菌试管斜面保藏菌种，转接于已灭菌的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，置培养箱内温度28℃±1℃，活化培养5～7天，得到活化菌种；

（2）种子培养

用无菌打孔器(内径5mm)在无菌条件下将活化菌种打成直接为5mm菌碟，接种5块菌碟于含有50ml液体培养基的三角摇瓶内，恒温摇床培养，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，培养2～3天，得摇床种子； 

（3）发酵培养

将摇床种子接种到装有50ml液体培养基的250ml三角摇瓶中，接种量5%，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，培养5～7天，得到加拿大一枝黄花内生真菌发酵液；加拿大一枝黄花内生真菌发酵液在无菌条件下过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到加拿大一枝黄花内生真菌的抗菌发酵液；

发酵培养特征：培养第1天，菌体为少量灰色的粉末；培养第3天，淡粉色的细粉末减少，出现黑色的小菌丝球；培养第5天，黑色菌丝球继续增多，并且体积变大，发酵液为黄褐色；培养第7天，出现大量黑色的菌丝球，体积也变大，发酵液为褐色；

所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂18克、蒸馏水1升； 

所述液体培养基：蛋白胨15克，葡萄糖 20克，氯化钙 0.5克，磷酸氢二钾0.1克，硫酸亚铁  0.01克，硝酸钠1克，水 1000 毫升，pH自然；