[发明专利]一种MALDI-TOF MS直接检测感染尿液病原菌前处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及临床标本病原微生物检测，属于微生物学领域。 

背景技术

泌尿系统感染(UTIs)在临床感染率占第二位，而传统方法(尿培养和鉴定)熬时比较长，临床医生往往不会等待实验室的结果，而是选择广谱的抗生素进行治疗，这就造成了临床细菌的耐药率逐年上升。 

UTIs感染诊断主要根据临床症状和实验室结果。患者在留取标本前应清洗外阴，并取中段尿于无菌容器内。主要实验室检查包括：尿液干化学检查、尿沉渣分析、涂片镜检、革兰氏染色镜检以及尿液培养鉴定。现在尿培养鉴定被认为是最好的方法，尿液接种于培养皿中，孵育18-24h，利用培养皿中长出的单个菌落进行鉴定。然而传统方法熬时比较长，花费较多，并且会有60-80％的标本是阴性结果。 

目前，基于质谱框架图谱的基质辅助激光解析飞行质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF)逐渐进入临床，应用于微生物检测，但检测标本主要是培养后菌落，细菌鉴定时间比传统方法要早1天。然而，MALDI-TOF MS很少用于原始标本的直接鉴定。本发明是想通过对MALDI-TOF MS的方法进行改进，提供一种能够在30分钟内、直接准确检测出临床尿液标本中病原菌的方法，从而指导临床用药。 

发明内容

本发明的目的是提供MALDI-TOF MS鉴定感染尿标本前处理方法。 

本发明所涉及的MALDI-TOF MS鉴定感染尿标本前处理方法是在细菌洗涤、集菌后，利用甲酸和乙腈对细菌进行蛋白溶出，加样，干燥后，加基质，干燥后上机检测。在保证检测准确的前提下，大大缩短了测定时间。 

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的： 

取1ml尿标本2000×g，离心30秒，取上清。15500rpm，离心5分钟，取沉淀。无菌水洗涤1次，干燥，备用。加入5μl甲酸(70％)和5μl乙腈，进行蛋白溶出过程，混匀，取1μl点靶，干燥后加1μl基质(α一氰基一4羟基肉桂酸饱和溶液，内含50％的乙腈和2.5％的三氟乙酸)，干燥后上机检测。 

检测步骤比较精简，减少了由于步骤繁琐所带来的细菌丢失。检测流程的简化，大大缩短了测定时间，为临床医生实施快速而有针对性的抗生素治疗提供了可靠的证据。 

附图说明

图1分别为改进方法的尿液中大肠杆菌MALDI-TOF质谱检测质谱图和鉴定结果； 

图2分别为改进方法的尿液中粪肠球菌MALDI-TOF质谱检测 质谱图和鉴定结果。 

具体实施方式

实施例1MALDI-TOF MS检测标本前处理 

临床上留取疑似泌尿系感染患者的清洁中段尿1456份，立即送检。取1ml尿标本2000×g，离心30秒，取上清。15500rpm，离心5分钟，取沉淀。无菌水洗涤1次，干燥，备用。加入5μl甲酸(70％)和5μl乙腈，进行蛋白溶出，混匀，取1μl点靶，干燥后加1μl基质(α一氰基一4羟基肉桂酸饱和溶液，内含50％的乙腈和2.5％的三氟乙酸)，干燥后上机检测。 

实施例2MALDI-TOF MS分析 

细菌质谱的获得需要autoflex III MALDI-TOF/TOF MS的激光强度为200Hz，检测范围为2-20kDa。离子的形成需要337nm的氮激光，解析延迟时间为40ns。每一个样本的检测，需要500个激光点被收集和分析(10×50激光照射点来源于上样靶的不同位置)。测定前需要蛋白标准1和多肽标准2的混合物进行校准。标本测定后形成质谱图，经MALDI BioTyper软件3.0进行分析与BioTyper细菌数据库进行比对，分值范围为0-3，测定分值＞1.9，说明鉴定到种；1.7＜分值＜1.9，说明鉴定到属；分值＜1.7，则鉴定结果不可信。