[发明专利]检测肝豆状核变性ATP7B基因突变的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种检测肝豆状核变性ATP7B基因突变的试剂盒。

背景技术

肝豆状核变性又称Wilson’s病（WD），是遗传性铜代谢紊乱的常染色体隐性遗传性疾病，主要累及中枢神经系统和肝脏。WD基因已被克隆且定位于13q14.3-21.1，有21个外显子和20个内含子，cDNA全长4398bp，其表达产物ATP7B蛋白为含1465个氨基酸的多肽，故本病基因又称为ATP7B基因。ATP7B基因突变形式较多，据(http://www.hgmd.org/)截止2009年12月已发现400种不同的突变，主要突变形式为错义突变，无义突变，缺失和插入等。ATP7B基因突变十分复杂，但以少数几个热点突变为主，伴有广泛存在的罕见突变为特征，具有明显的种族和区域差异性，并且WD患者大多为复合杂合子突变，少数为纯合突变该病在世界各地广泛存在，流行病学调查显示地中海人群中每5000人中就有1人患病，每90人中就有1人是致病基因的携带者。多数研究已证实His1069Gln为欧洲人的一个典型突变热点，而亚洲人的突变热点为Arg778Leu，中国人群中Arg778Leu发病率为70%，因此基因检测位点的选择要有种族特异性和针对性，避免无的放失。与患者拥有相同基因型的家族成员，尽管没有临床症状也应该尽早治疗，而临床症状或生化检查都模棱两可的家族成员，有可能是杂合子携带者需加以关注。基因鉴定的方法不仅显著提高了不典型病例的诊断率，使肝豆状核变性发病年龄的确认被分别提前至3岁和延后至70岁，同时利用基因鉴定进行产前诊断也成为有效降低发病率的重要手段。对患者的同胞进行基因检测将有可能将诊断提前至无症状的临床前期，并同时避免不必要的驱铜治疗。因而寻找更经济、快捷的基因鉴定法使该项检查能够在所有高危人群中得到应用。

“HRM”（High-Resolution Melt analysis）高分辨率溶解曲线。2002年，美国Utah大学和Idaho科技公司共同合作开发了HRM技术，是近年来新兴的一种核酸序列分析技术，具有极高的特异性和灵敏度。HRM与SYBRGreen染料溶解曲线功能相似，只是收集信号更多。HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。HRM方法优点是检测遗传变异是高度特异且精确，低成本（无需序列特异性探针），操作简便，快速，高通量。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种检测肝豆状核变性ATP7B基因突变的试剂盒，可用于检测ATP7B基因突变位点，特异性好，灵敏度高。

检测肝豆状核变性ATP7B基因突变的试剂盒，其特征在于，包括：

(i)PCR扩增反应试剂；

(ii)用于扩增样本DNA中ATP7B基因的PCR引物：

exon 8:Forward:5’AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3’

Reverse:5’AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3’

exon 12:Forward:5’ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’

Reverse:5’AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3’。

进一步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：

(i)采集待测血液样本，提取DNA；

(ii)以该DNA为模板，用所述用于扩增样本DNA中ATP7B基因的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR反应产物，进行HRM实验；

(ⅲ)HRM分析：确定是否存在第778个碱基G→T突变位点或第952个碱基G→A突变位点。

步骤(ii)的PCR反应按以下条件进行扩增：94℃2min；98℃10s、57℃30s、68℃25s，20个循环；最后68℃5min。

由于中国人的WD突变主要在ATP7B基因外显子8，12上，所以从外显子8，12上设计引物为：

exon 8:Forward:5’AAACCCTTCACGTTCCTTGTCA 3’296bp

Reverse:5’AAGGCAGCTCTT TTCTGAAA 3’

主要检测Arg778Leu错义突变(CGG→CTG)；

exon 12:Forward:5’ACTT GTGGTGT TTTATTT CT TCA 3’229bp

Reverse:5’AACCACCAT ATAGCCCAAGA 3’