[发明专利]一种免疫类毒素的制备方法

说明书

技术领域

[0本发明涉及一种药品原料的制备方法，尤其是一种免疫类毒素的制备方法。

背景技术

一种致病性细菌所产生的特异性毒性物质—细菌毒素经脱毒处理而保留免疫原性称之为类毒素。类毒素是一种自动免疫制剂，用于细菌毒素性疾病的预防及治疗。

现常用生产类毒素的方法是选择培养基和菌种，菌种经人工培养后产生毒素，毒素脱毒后形成类毒素。目前，非常成熟的类毒素有破伤风类毒素、白喉类毒素、霍乱类毒素等产品。

CN101869704A公开了单剂免疫破伤风类毒素阳离子葡聚糖微球及其制备方法，其特特征是：由破伤风类毒素通过静电作用后栽在阳离子甲基丙烯酸羟乙酯葡聚糖微球上制得。

ZL87104279公开了类毒素制备新方法，包括用一定量氧化剂处理至少部分分离的毒素，以对所说毒素进行化学灭活，但同时保留其免疫性，此后从中获得灭活的毒素。

CN1798548公开了基于含吸附类毒素和含多糖抗原微粒体的免疫原性组合物，该发明是将类毒素抗原或含多糖的抗原吸附在微粒体上形成免疫原性组合物。

蟾蜍是一种两栖动物，生存环境是阴湿、细菌病毒滋生的区域，蟾蜍生命力极强，抗性应答产生大量的毒素以抵抗外界细菌、病毒的侵蚀。

发明内容

现有的类毒素生产采用菌种和培养基为主要生产原料，菌种经人工培养后产生毒素，毒素脱菌后形成类毒素，因此菌种及培养基筛选的局限性，培养过程的长周期性都影响类毒素的产量和质量。

针对现有类毒素培养方法存在的问题，本发明提供一种以中药材蟾蜍或蟾蜍干皮为原料的免疫类毒素的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：（1）以蟾蜍的鲜品或干品为原料，破碎或粉碎；

（2）然后加入纯净水搅拌均匀，固液比为1kg：2～30L，加入0.1～100g胰蛋白酶，在25～50℃酶解4～48h；

（3）用分离机以3000～15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用缓冲液调pH=7.0～9.0，控制温度为25～45℃，加1～100g戊二醛或甲醛脱毒处理30～60d，成为免疫脱毒液粗品；

（4）将1kg免疫脱毒液粗品加入氨水调pH=8～10，再加入100～300g硫酸铵及10～500g活性白土，常温条件下生成沉淀并放置1～24h；

（5）上述物料用膜孔径0.2～10μm微孔过滤机过滤并且用膜孔径8～120nm超滤机超滤处理，收集超滤液；

（6）收集的超滤液注入到分离柱中，在压力0.2～5Mpa、流速10～500mL/min条件下分离纯化得免疫类毒素；

（7）分离纯化的免疫类毒素用氢氧化铝溶液或磷酸钙溶液吸附，常温条件吸附时间12～24h，成为稳定性免疫类毒素。

本发明的免疫类毒素是以中药材蟾蜍或蟾蜍干皮为原料制备的一种类毒素，采用蟾蜍为基本原料生产类毒素，解决了菌种及培养基筛选的局限性问题而且没有培养过程，由于各种蟾蜍的毒素成分清楚，其工艺简单实用，成本低，因此本发明脱毒过程易于控制能保证类毒素的生物活性。为中药材蟾蜍的应用提供了更加广泛的途径。

附图说明

图1为膨胀溶剂体系提取装置的结构示意图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式按照下述方法制备免疫类毒素：1、以中华大蟾蜍或黑眶大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍的鲜品或干品为原料经破碎或粉碎；2、用化学缓冲溶液在一定温度、时间、压力条件下提取；3、分离机固液分离；4、酸沉法或有机溶剂法或变温法去蛋白；5、化学法或物理法灭活；6、微滤过滤及超滤法浓缩；7、凝胶色谱层析分离并用超声驻波液相制备色谱纯化；8、稳定化处理；9、将免疫类毒素作为活性成分并与适宜的赋形剂相结合制备成药品用于调节人体机能免疫功能。具体方法如下：

（1）选用中华大蟾蜍或黑眶大蟾蜍或花背大蟾蜍或蔗地大蟾蜍的干品用粉碎机粉碎至过100～150目筛，收集粉末；

（2）将1000g粉末放入微波炉中以功率1000～2500W，加热1～20min杀菌处理，然后自然冷却至室温；

（3）上述冷却至室温的粉状物加入2～20L纯净水混合均匀后，加入0.1～50g胰蛋白酶，保持温度25～50℃，酶解4～48h；

（4）用分离机以3000～15000r/min分离上述酶解物，收集的液体用0.2mol/L磷酸氢二钠与0.1mol/L柠檬酸组成的缓冲液调pH=7.0～9.0，控制温度为35～45℃，加1～100g戊二醛脱毒处理30～60d，成为免疫脱毒液粗品；