[发明专利]生产安丝菌素的发酵培养基

说明书

技术领域

本发明涉及到一种改进的生产安丝菌素的发酵培养基，属于生物工程与技术领域。

背景技术

安丝菌素（Ansamitocin）是珍贵束丝放线菌（Actinosynnema pretiosum）产生的美登素类（Maytansinoid）抗肿瘤抗生素。其母核为19-C的大环内酰胺环（安莎类）或I型多聚酮类，C-3侧链连接有不同长度的碳链，主要成分为AP3，其侧链为异丁酰基（本说明书中用AP3代指安丝菌素P3）。AP3的分子量为635.2，分子式为C₃₂H₄₃ClN₂O₉，难溶于水（纯水中溶解度20mg/L，室温常压），易溶于甲醇、乙醇，丙酮，氯仿，乙腈等溶剂。AP3分之式见附图1。安丝菌素具有很强的真核细胞毒性和抗肿瘤活性，作用机理是覆盖微管的长春花碱结合点，从而阻止了微管的聚合。

无论临床前、临床研究还是最终药物生产，都需要足够的安丝菌素原料，因此大规模高产工艺也是研究的重点之一。目前报道的安丝菌素AP3最高产量是，使用的是基因突变株Actinosynnema pretiosum PF4-4（ATCC PTA-3921）在900L发酵罐规模中304mg/L，20mL/250-mL摇床中435mg/L（专利CN 101103120A，WO 03/064610A2）。对于常用的标准菌种Actinosynnema Pretiosum Ssp.Aurantium（ATCC 31565）,报道的最高产量是86mg/L，最大规模是1100L（CN 1432068A）；摇床阶段，标准菌种的400多例的摇瓶统计学效价为61±35mg/L，极大值最高不超过221mg/L（WO 03/064610A2）。

在中国，安丝菌素的发酵技术研究文献很少，主要是采用固体发酵（CN 101319241A，2008；CN 1490322A,2003，没有效价报道和效价低于40mg/L）。最近的文献是摇瓶液体发酵效价68mg/L（韩国配方）（JINXIA LIN，2010）。

对AP3发酵配方的研究，文献（CN 101103120A，2005；WO03/064610 A2，2003）列举了很多配方，其主要培养基组分是：糊精、麦芽糖、Proflo（棉籽粉）、大豆粉、玉米浆蛋白等，并公开部分突变株在各种配方中的AP3效价表现，但没有详述各组分的最佳浓度范围。韩国有几篇文献（BANDI等，2005，2006）公开了培养基配方组份筛选的研究过程。韩国2005年发表的论文中，作者先用Plackett-Burman法筛选因子，11个组分入选：葡萄糖、麦芽糖、糊精、蔗糖、酵母抽提物、豆饼粉、酸水解酪素、Polypeptone（多聚肽粉）、玉米浆、棉籽粉、豆胨。从中选出四个：蔗糖、糊精、多聚肽粉、酵母抽提物，经过2轮RSM CCD（响应曲面法中心组合设计）筛选出最佳浓度范围：4.5%蔗糖、4.5%糊精、0.16%多聚肽粉和0.86%酵母抽提物。摇瓶30mL/250mL使用ATCC 31565标准菌种的表达效价是45.2mg/L。韩国2006年发表的论文中，使用了突变改造的asm-菌种，用2轮RSMCCD筛选出最佳浓度范围：糊精6.0%、麦芽糖3.0%、棉籽粉0.53%和酵母抽提物0.45%。30mL/250mL摇瓶asm-菌种AP3效价最高点79.0mg/L。而韩国（Ychang,2004）在更早的时候还发表了会议论文，有显著影响的培养基成分是葡萄糖、酵母抽提物、麦芽抽提物、乳糖、KH₂PO₄和CaCO₃，没有报道实际的AP3效价。

总的来看，培养基的主要C源是糊精、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖；而主要N源则很多：棉籽粉、大豆粉、玉米浆、多聚肽粉、酵母抽提物。明显，C源成分比较稳定，而N源都是有机复合物，成分复杂，不同来源和批号的N源很难保持发酵原料质量的稳定。珍贵束丝放线菌也能代谢硝酸盐（USP 4356265,1982）和铵盐。专利（WO 03/064610A2，2003）中一个配方也含有(NH₄)₂SO₄0.05%w/v。然而，林锦霞等（JINXIA LIN，2010）研究了培养基中铵离子对AP3产率、关键酶活和转录活率的影响。其结论是铵离子能显著降低AP3效价，但对生物量、糖耗、异丁醇的消耗影响不大。

发明内容