[发明专利]串联液相色谱-质谱法测定食品中刚果红的方法及应用

说明书

一．技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及应用串联液相色谱质谱联用技术对各种食品中非法添加的刚果红染料进行准确测定的方法及其应用。

二．背景技术

刚果红(Congo Red，Direct Red 28，CAS 573-58-0)又名直接大红28，属于联苯胺为母体的红色偶氮染料，一般用于临床诊断，指示剂、生物染色剂及化学指示剂等。它对各种动物机体为可疑致癌物与诱变剂，并对胎儿性腺发育产生不良影响，同时，在特定条件下，刚果红可降解释放出联苯胺类物质。由于对人体健康的危害很大，在很多国家已经成为禁用偶氮染料。

近年来食品安全事件频繁发生，其中添加非食用甚至有毒物质的情况尤为突出，基于价格便宜、着色强、稳定性强等特点，非食用工业染料被应用到食品加工中。不法食品加工商为使肉制品色泽鲜艳，从外观上吸引顾客，随意使用有毒的工业染料代替食用色素加以使用，对广大群众的身体健康造成极大的危害。本机构在食品风险监测过程中发现肉制品中被非法添加一种红色未知染料，经确证为致癌偶氮染料刚果红。刚果红不是食品添加剂，而是一种有毒的非食用物质，在食品中添加非食用物质是严重威胁人民群众饮食安全的犯罪行为，同时也是阻碍我国食品行业健康发展、破坏社会主义市场经济秩序的违法犯罪行为。因此有必要建立一种灵敏、准确、快速的肉制品中刚果红的检测方法。

国内外有关食品中刚果红染料的测定未见报道，侍芳采用液相色谱单级质谱（LC-MS）测定了环境水样中刚果红的含量，该方法由于样品基质及仪器设备的限制，不适用于食品中刚果红的准确测定。由于食品基质比较复杂，加上食品中非法添加的工业染料多为水溶性盐类，前处理多采用固相萃取（SPE）、液液萃取（LLE）以及基质固相分散（MSPD）等技术去除样品中的大量杂质，而后采用液相色谱及液相色谱质谱联用法对其进行测定。

三．发明内容

本发明需要解决的问题是采用串联液相色谱质谱联用法准确测定食品中刚果红的方法及应用。首先，如何从食品中快速有效的将非法添加的刚果红染料快速提取出来，同时最大限度减低基质干扰。经过大量的试验筛选，本发明最终选择乙腈-正己烷按体积比1:1混合的溶剂作为样品的提取溶剂，考虑到乙腈会溶解一部分正己烷，因此乙腈要预先用正己烷溶液饱和，这样定量计算时不至于产生误差。刚果红非常容易溶解于乙腈等强极性溶剂，而几乎不溶于正己烷，且正己烷是一种油脂的良好溶剂，可以有效的去除油脂。样品经混合溶剂提取后，刚果红富集于乙腈层中，弃去的正己烷中含有大量的低极性杂质，这样简单快速的前处理步骤是非常有效的。其次，如何选择最优的色谱及质谱条件，使得在尽可能短的时间内对样品中的刚果红染料进行分析，并产生最高的灵敏度。本发明在对刚果红染料性质进行详细了解的前提下，不断优化仪器条件，最终选定的液相条件为采用10 mmol甲酸铵水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱，质谱采集m/z 651.0/152.0及m/z 325.0/416.0离子信号，分别作为定量离子对与定性离子对进行分析，使用外标法定量。

本发明的技术方案包括：

1. 质谱参数的选择与优化  

在实验前采用系统的autotune功能对质谱系统各参数进行快速优化。刚果红分子量为696.69，选择扫描范围m/z100-1000，断开色谱柱，进样器将标准溶液直接进质谱分析，同时采集正负离子信号，发现目标物在负离子模式下的响应值远大于正离子模式，该现象和刚果红带两个磺酸结构有关。刚果红的一级质谱在ESI负离子化模式下产生m/z 651.0[M-2Na+H]-及m/z 325.0[M-2Na]2-两个离子信号，符合文献报道的联苯胺偶氮染料电喷雾质谱特征。选择m/z651.0进行子离子扫描，生成的主要碎片离子为m/z 152.0，其为母离子失掉两侧偶氮苯磺酸结构后剩余的联苯基团（图1.C），改变碰撞电压没有其他明显离子出现。再选择m/z325.0进行子离子扫描，生成的主要碎片离子为m/z416.0，其为母离子一侧的偶氮N=N键断裂后剩余的碎片基团（图1.C），因刚果红为对称结构，它的丰度较前者要高，适合作为定量离子，同时改变碰撞电压也没有其他明显离子出现。将相关联的离子对中丰度较大的一对即325.0/416.0作为定量离子对，651.0/152.0作为定性离子对。最后对其裂解电压参数及碰撞电压进行优化，选择本发明中具体实施方案2中规定的质谱条件进行检测。

 

2. 色谱条件的优化