[发明专利]快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法

说明书

技术领域

    本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种快速检测食品中单核增生李斯特菌的方法。

技术背景

   目前，李斯特菌属共包含8个种，而绝大多数人体感染的李斯特菌都与单核增生李斯特菌（L. monocytogenes）有关。对于非孕妇的的个体，单核增生李斯特菌感染会引起脑膜炎和脑膜脑炎；对于孕妇，主要感染还未出生的婴儿。在感染过程中单核增生李斯特菌可以从一个细胞扩散到邻近的其他细胞。通常单核增生李斯特菌会在腐烂的植物体和泥土中发现，同时它也会通过饮水和食物进入家畜的体内并定植在其胃肠道。人体会因食用受感染的家畜的肉或奶而患病。食用受单核增生李斯特菌污染的食物，例如干酪、香肠、牛奶等，是其感染的主要途径，其致死率可高达30%。

供食用的家畜及其相关产品是单核增生李斯特菌污染的主要来源。因此，为了确保食品安全，在食物生产的各个环节控制微生物的污染相当重要。目前，对于单核增生李斯特菌检测主要的方法还是培养法和血清学的检测方法，包括富集、选择性培养、生化鉴定。血清分型，有时还要进行毒性检测。如(杨瑞军, 生肉食品中致病菌检测结果分析[J]中国卫生检验杂志.2009:19（9）2122-2125)，传统的方法具有劳动强度高、耗时、费用高等缺点。此外，传统方法检测灵敏度比较低而且特异性不强，尤其对于来源相近的菌株，传统方法很难通过生理生化的方式加以区分。因此，为了确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的单核增生李斯特菌。

发明内容

    本发明是目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、使用方便、检测快速高效、灵敏度高的单核增生李斯特菌快速检测方法。

 本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

包括如下步骤：

（1）取食物样本，加缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除大的食物残渣，取上清得菌悬液，整过程均为无菌操作；缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。

（2）取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶（PMA）溶液，使PMA的终质量浓度为3 μg/mL，混匀后室温避光培养3 ~8min（优选为5min），卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；PMA溶液配制方法为PMA溶解于二甲亚砜( DMSO) 中，配制成0.5 mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。

（3）取DNA，进行LAMP反应，LAMP反应所用的引物为：

上游外引物F3（5’→3’）： AAGCTGCTTTTGATGCTG

下游外引物B3（5’→3’）： TCGATTAAAAGTAGCGCCTT

上游内引物FIP（5’→3’）：CGGCTTTGAAGGAAGAATTTTTGAT-CGTAAGCGGAAAATCTGTC

下游内引物BIP（5’→3’）：TACGGAGGTTCCGCAAAAGA-TTTTCAAAATATCGCGTAAGTCTC

上游环引物LF（5’→3’）： ATTTGTTAGTTCTACATCACCTG

下游环引物LB（5’→3’）:AAGTTCAAATCATCGACGGC

为了达到更好的反应效果，LAMP反应条件为：0.8 M 甜菜碱, 2 mM MgSO4, 1.4 mM dNTP, 1.6 uM内引物 FIP/BIP, 0.4 uM 外引物F3/B3, 0.8 uM 环引物LF/LB；将扩增反应体系于62 ^oC孵育45 min，85 ^oC 孵育5 min，终止反应。

（4） LAMP反应结束后，取反应液检测单核增生李斯特菌存在。取反应液检测单核增生李斯特菌存在可以为取反应液用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有梯度条带处在，且最小条带为180 bp，则说明有单核增生李斯特菌存在；或取反应液加入SYBR green I荧光检测，若反应液出现绿色，则说明有单核增生李斯特菌存在。

与现有技术相比，本发明有如下有益效果：

1、采用本发明的检测单核增生李斯特菌的时间更短，可在2.5个小时内得到结果，同时本发明克服了一般的分子生物学检测方法无法区分死菌与活菌的缺陷；

2、本发明针对单核增生李斯特菌的特异性基因设计特异性引物，并特定的反应条件，可在62°C, 45 min内的出结果。

3、取反应液检测单核增生李斯特菌存在，可以无需电泳检测，直接可通过荧光观察，操作简便，结果判定简单，降低了检测成本。