[发明专利]一种己烯雌酚半抗原、人工抗原及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及一种己烯雌酚半抗原、人工抗原及其制备方法。

背景技术

己烯雌酚（Diethylstilbestrol），分子式C₁₈H₂₀O₂，为人工合成的二苯乙烯类雌激素药，难溶于水，易溶于有机溶剂。由于己烯雌酚在促进动物蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和减少脂肪等方面效果明显，曾经作为促生长剂广泛应用于水产养殖业和畜牧业，以达到促生长目的。然而从20世纪50年代起，人们开始意识到己烯雌酚残留的严重危害性，现已证明，己烯雌酚具有明显的致畸、致癌和生殖毒性，目前包括我国在内的许多国家和地区都禁止其用作动物饲料添加剂。但在我国部分生产者盲目追求养殖经济效益，己烯雌酚在水产业和畜牧业仍然在广泛使用甚至滥用，导致水产品和畜产品中己烯雌酚残留严重超标，严重危害着人民的身体健康，其中尤以水产品（如黄鳝、甲鱼、螃蟹等）的情况最严重。同时由于水产品具有不易储存、易变质等特点，为了保障消费者的身体健康，迫切需要建立快速、简便、价廉、灵敏、特异的己烯雌酚测定新方法。

目前，水产品中己烯雌酚的常用检测方法是高效液相色谱法，该方法特异性强、灵敏度高，但是该类技术所需设备要求较高，对操作人员的要求也较高，难于推广；而免疫分析，特别是酶联免疫吸附分析法（ELISA）具有操作简便快速、成本低、灵敏度高、特异性强、分析样本量大的优点。因此，ELISA方法在对水产品所含己烯雌酚的检测中起着越来越重要的作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种己烯雌酚半抗原。

本发明提供的己烯雌酚半抗原，其结构式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ。

本发明的另一个目的是提供一种上述的己烯雌酚半抗原的制备方法，包括如下步骤：

1）己烯雌酚与溴苄间甲酸甲酯在70℃-80℃反应3-5小时，得到中间产物；

2）水解所述中间产物，即得到上述的己烯雌酚半抗原。

上述方法中，步骤1）中，所述己烯雌酚与所述溴苄间甲酸甲酯的质量比为268：260；

所述反应是在有机溶剂中进行，所述有机溶剂为含有4-二甲氨基吡啶、三乙胺和KOH的二甲基甲酰胺溶液。

步骤2）中，所述水解采用LiOH水溶液；所述水解的时间为3h-6h。

上述方法中，在所述步骤1）和步骤2）之间，还包括将所述中间产物依次经乙酸乙酯萃取收集有机相、干燥、浓缩的步骤；

步骤2）中，在所述水解所述中间产物后还依次包括将水解产物用乙酸乙酯萃取收集有机相A、再调节所述有机相A的pH值为5-5.5、再次乙酸乙酯萃取收集有机相B，再将所述有机相B经薄层层析纯化，收集R_f值为0.35-0.48的物质，得到所述的己烯雌酚半抗原；

所述薄层层析的流动相具体为体积比为3:50的CH₃OH和CH₂Cl₂的混合物。

本发明的第三个目的是提供一种己烯雌酚抗原。

本发明提供的己烯雌酚抗原为上述的己烯雌酚半抗原和载体蛋白偶联，得到己烯雌酚抗原。

上述己烯雌酚抗原中，该载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）；

上述己烯雌酚抗原中，上述己烯雌酚半抗原和牛血清白蛋白的偶联比为5.8:1。

上述己烯雌酚抗原的结构式如式Ⅱ所示：

式Ⅱ。

本发明的第四个目的是提供一种制备上述的己烯雌酚抗原的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

将上述的己烯雌酚半抗原溶液加入载体蛋白溶液中，反应，得到所述的己烯雌酚抗原。

上述方法中，所述己烯雌酚半抗原溶液按照如下方法制备：将1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、N,N-二甲基甲酰胺和上述的己烯雌酚半抗原混合，得到所述己烯雌酚半抗原溶液；

所述载体蛋白溶液为将所述载体蛋白溶于pH为7.4、浓度为0.01M磷酸盐缓冲液得到的溶液。

上述方法中，所述反应和所述混合的时间均为12h-16h；

所述1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺、所述N,N-二甲基甲酰胺和所述己烯雌酚半抗原的配比为36mg:36mg:3ml：20mg。