[发明专利]用于检测呋喃它酮残留标示物AMOZ的单抗及酶联免疫方法与试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于检测分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒。

背景技术

呋喃它酮属于硝基呋喃类药物，具有5-硝基呋喃环的基本结构，是一种广谱抗菌药，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原虫等均有效，曾在养殖业中被广泛使用。毒理学试验证明呋喃它酮及其代谢物均有显著的致癌、致突变等严重毒性作用。欧盟已于1993年禁止呋喃它酮在养殖业中使用，我国发布的193号公告《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》将硝基呋喃类药物列入禁用清单。

由于呋喃它酮价格便宜、药效快，目前仍有很多养殖户违禁使用。我国对硝基呋喃类药物的残留监控形势依然严峻，必须尽快完善筛选检测体系，以保证公众的生命健康安全和促进国内外经济贸易的顺利进行。

HPLC-MS/MS是目前公认的硝基呋喃类药物残留检测的确证手段，对牛奶、蛋类、猪肉、禽肉、及虾肉等样品的检测限可达0.1~0.3μg/kg。虽然该方法的灵敏度和精确度均很高，但需要配备昂贵的仪器和专业技术人员，不适合室外操作及高通量筛选。

用于高通量筛选的免疫学检测方法是基于抗原抗体的生物学反应，灵敏度高并且易于操作。Umaporn Pimpitak等(2009)等制备了AMOZ的单克隆抗体，抗体的IC₅₀值(以CPAMOZ计算浓度)为0.023μg/L，采用直接竞争ELISA方法对虾肉样品中AMOZ残留进行了检测。但是，该方法需要先将AMOZ与对醛基苯甲酸进行反应后再进行检测，反应的效率低，不能得到广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种能识别呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的单克隆抗体和检测呋喃它酮残留标示物AMOZ的酶联免疫方法与试剂盒。本发明还提供所述单克隆抗体在制备检测呋喃它酮残留标示物AMOZ的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在呋喃它酮残留标示物AMOZ检测中的应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞AMOZ所分泌的。

所述的杂交瘤细胞AMOZ，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:C201188。

所述的单克隆抗体在制备检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫试剂盒中的应用。

包含所述的单克隆抗体的试剂盒。

所述的试剂盒，是用于检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫试剂盒。

所述的试剂盒在呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮检测中的应用。

一种检测呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮的酶联免疫方法，包括以下步骤：

(1)将3-对醛基苯甲酸基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(CPAMOZ)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原(CPAMOZ-BSA偶联物)；

(2)将3-对醛基苯甲酸基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(CPAMOZ)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原(CPAMOZ-OVA偶联物)；

(3)利用步骤(1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201188的杂交瘤细胞AMOZ；

(4)用保藏号为CCTCC NO:C201188的杂交瘤细胞AMOZ制备单克隆抗体；

(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；

(6)样品前处理：将待测样品用酸处理，加入苯甲醛超声衍生后，用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层氮气吹干、正己烷净化和样品稀释液重新溶解得到待测物。

(7)对步骤(6)的待测物进行酶联免疫检测。

所述的酶联免疫方法在呋喃它酮残留标示物3-氨基-5-吗琳代甲基-2-恶唑烷酮检测中的应用。

本发明的有益效果是：

1．本发明制备的单克隆抗体能够识别3-苯甲醛基-5吗琳代甲基-2-恶唑烷酮(PAMOZ)，而PAMOZ是呋喃它酮的残留标示物AMOZ与苯甲醛反应的衍生产物。

2、本发明不需要将AMOZ与对醛基苯甲酸进行反应后再进行检测，而是与苯甲醛进行反应后再进行检测，检测效率高。

3、本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及提供的酶联免疫方法检测灵敏度、精密度高、准确度好。