[发明专利]一种含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的基因疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明的实施方式涉及生物医学技术领域，具体涉及一种含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的基因疫苗的制备方法。

背景技术

目前已经确认幽门螺杆菌(helicobacter pylori，H．Pylori，Hp)与上消化道疾病中的一些疾病密切相关，包括胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌。幽门螺杆菌全菌有非常复杂的抗原成分，此菌菌种保存不易、生产周期长、产量低、易受污染。随着分子生物学的发展，人们迅速投入了对Hp各种特殊基因的研究，已成功克隆了十多种Hp不同的基因组或基因，其中包括：趋化因子cheA和cheY、细胞毒素相关基因cagA和cagC、鞭毛素基因flaA和flaB、热休克蛋白质基因hspA、空泡毒素基因vacA、尿素酶基因ureA、ureB、ureC、修复基因recA、空泡毒素基因vacA、碱性磷酸酶基因组等。目前已发现重组的尿素酶、热休克蛋白、细胞毒素相关蛋白、空泡毒素、黏附素等亚单位蛋白或融合蛋白均可以作为免疫原刺激机体产生保护性免疫反应。此外还发现幽门螺杆菌核酸疫苗也存在重要的免疫保护性。

细胞毒素相关蛋白（CagA）：CagA是一种亲水性免疫显性蛋白，免疫原性强，是Hp cag毒力岛的标志，相对分子质量为120000～140000，位于细菌表面，与消化性溃疡、萎缩性胃炎及胃癌的发生密切相关，能刺激胃上皮细胞分泌IL-8，促进粒细胞在胃黏膜中聚集，从而发生严重的炎症反应。cagA基因5’端高度保守，3’端区域含有数目可变的谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸（EPIYA）重复序列，CagA大小的变化与cagA基因3’端存在的重复序列有关。

Ghiara、han、黄琛等对cagA基因做了许多研究，包括克隆cagA基因、在大肠杆菌中表达重组的cagA，将表达蛋白免疫小鼠。结果酶联免疫吸附试验（ELISA）证明表达的蛋白都具有强弱不等的抗原性，不仅成功清除了小鼠胃内的Hp，而且有效保护小鼠免遭Hp的再感染，可见重组的CagA全长或片段都有较强的免疫原性，是幽门螺杆菌疫苗的首选抗原之一。

尿素酶及其亚单位（ureA、ureB、ureC等）：是幽门螺杆菌的定植因子和毒力因子，为幽门螺杆菌在胃内生存的必要条件。研究表明所有幽门螺杆菌菌株均能产生尿素酶，并且序列高度保守，表达量高。尿素酶一组基因位于4.2kb的DNA片段中，有4个开放读码框（ORFs），编码相对分子量分别为26 500（尿素酶A亚单位，UreA）、61 600（尿素酶B亚单位,UreB）、49 200（尿素酶C亚单位,UreC）、15 000（尿素酶D亚单位,UreD）的多肽。A和B两个亚单位是主要的功能单位，以1：1的比例构成一个基本的酶分子，UreC和UreD的功能目前还不清楚，可能为调节基因。其中以B亚单位抗原性和保护作用最强，是幽门螺杆菌免疫防治的主要候选疫苗之一。

研究表明，单一的幽门螺杆菌抗原免疫水平低，但多种抗原成分联合免疫可以提高免疫性，可使100％的小鼠避免幽门螺杆菌感染。姜政、朱森林等成功克隆并融合表达了Hp的hsp和外膜蛋白，Western印迹法检测显示重组蛋白有良好的免疫原性，构建了UreB/hpaA双价抗幽门螺杆菌活疫苗。

发明内容

本发明克服了现有单一幽门螺杆菌基因疫苗免疫水平低的不足，提供一种幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白联合免疫的基因疫苗的制备方法，以达到提高免疫性，避免幽门螺杆菌的感染的目的。

为解决上述的技术问题，本发明的一种实施方式采用以下技术方案：

本发明提供了一种幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白疫苗的制备方法，其具体步骤如下：

以EcoRⅠ、PstⅠ分别正向酶切重组质粒pUC-ureB及pUC-cagA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳割胶回收目的片段，连接并转化，挑取抗性克隆扩增，抽提质粒，得到pUC-ureB-cagA，酶切鉴定。

采用氯化钙法将表达载体pIRES转化受体菌DH5a感受态细胞，筛选氨卞西林抗性菌落选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，得到pIRES。

分别将抽提所得pIRES及重组质粒pUC-ureB-cagA双酶切，所使用的两种酶为EcoRⅠ、PstⅠ，然后将酶切产物分别进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段。

将pUC-ureB-cagA经双酶切所得的ureB-cagA片段插入pIRES的EcoRⅠ、PstⅠ切点。获得连接产物pIRES-ureB-cagA。