[发明专利]电场作用下用微孔阵列固液相捕获单分子模板DNA的方法

权利要求书

1.一种电场作用下用微孔阵列固液相捕获单分子模板DNA的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）构建具有微孔阵列的DNA电化学传感器，所述微孔阵列的微孔侧壁上的SiO₂绝缘层通过羧基偶联固定P1接头DNA片段；

（2）在模板DNA的单链末端连接有与P1接头DNA片段互补配对的P1接头互补DNA片段，对模板DNA进行PCR扩增；

（3）通过电场作用使PCR扩增后的模板DNA进入微孔中与固定在微孔阵列的侧壁上P1接头DNA片段进行互补配对连接，完成单分子模板DNA的捕获。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）中P1接头DNA片段具有SEQ No：1~3的连续核苷酸序列；P1接头互补DNA片段具有SEQ No：4~6的连续核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中模板DNA的单链另一末端还连接有用于PCR扩增模板DNA的P2接头DNA片段；所述P2接头DNA片段具有SEQ No：7~9的连续核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中模板DNA的PCR扩增是在加入到DNA电化学传感器的微孔阵列流室内前进行；或者将模板DNA和PCR反应体系一同加入到具有P1接头互补DNA片段的模板DNA先加入到DNA电化学传感器的微孔阵列流室内DNA电化学传感器的微孔阵列流室内进行PCR扩增。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法步骤（3）中PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA和作为PCR扩增引物的P2接头DNA片段，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液 终浓度1～10×；

dNTPs 0.01～1.5mM；

引物序列 终浓度为0.01～2μM；

模板DNA 0.01～10ng/μL；

TaqDNA聚合酶 0.01～1.0U/μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法步骤（2）模板DNA的制备方法包括以下步骤：

1）将用于制作模板DNA的目的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端连接有末端标记生物素的P1接头互补DNA片段，并与目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列；

2）使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体，所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；

3）使用第二引物对亲和素结合后的目的基因区域序列进行第二次单向PCR扩增；所述第二引物一端连接有P2接头DNA片段，并与所述目的基因区域序列互补结合，且与第一引物进行PCR扩增的扩增方向相反；

4）将第二次单向PCR扩增后的目的基因区域序列除去亲和素生物素复合物，得到带有P1接头互补DNA片段和P2接头DNA片段的单链DNA文库作为模板DNA或形成双链的模板DNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中亲和素选自卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中固相载体为磁性微球。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步骤（1）中所述DNA电化学传感器包括CMOS衬底，所述CMOS衬底上沉积有氮化硅层，所述氮化硅层上覆盖二氧化硅绝缘层；所述二氧化硅绝缘层为具有微孔结构的微孔阵列，所述微孔侧壁上SiO₂绝缘层通过羧基偶联固定P1接头DNA片段。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述方法SiO₂绝缘层的微孔侧壁采用羧基化方法进行羧基化处理，然后使将氨基化的P1接头DNA片段与SiO₂绝缘层表面的羧基进行键合偶联固定；羧基化方法采用的试剂为丁二酸，羧基化方法的温度控制在75℃；偶联反应以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）为羧基的活化试剂。