[发明专利]一种应用8重PCR进行胡杨群体遗传分析和亲子鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传学研究领域，该发明公开了一种可同时对胡杨(Populus euphratica，Torr&Gray)全基因组上8个SSR位点同时进行扩增的方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是现今生物监测和分子标记中最常用的扩增技术，它可将某一DNA片段在几小时内扩增几十至几百万倍。随着荧光标记PCR技术的普及和应用，目标片段的定量可以精确到1bp。但是一般PCR仅应用一对引物，通量较低，成本很高，在对于大群体、多位点的遗传学研究中，建立一种高效、高通量的方法，显得十分迫切和必要。

多重PCR(Multiplex PCR)是在普通普通PCR的基础上加以改进，于一个反应体系中加入多对特异性引物，针对同一模板的不同区域扩增多个片段的PCR技术。这一概念由Charnberian等[Nucleic Acids Res.1988，16：11141-11156]率先于1988年提出。由于多重PCR可以对多个位点同时进行扩增，具有省时、高效、降低成本和节约DNA模板的优点，对于一些模板较珍贵样本尤其重要。因此，该方法一经提出后，即得到广泛应用并迅速发展，在生命科学领域中已经成为一种重要的研究手段。

由于多重PCR要求在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增，因此技术难度增大。迄今为止，公开发表的成功的4重以上的多重PCR较少。为了得到理想的多重PCR反应体系，需要针对引物和DNA模板的浓度、引物设计和组合进行优化。

本发明研究对象为胡杨。胡杨是荒漠地区特有的珍贵森林资源，它对于稳定荒漠河流地带的生态平衡，防风固沙，调节绿洲气候和形成肥沃的森林土壤具有十分重要的作用，是荒漠地区农牧业发展的天然屏障。同时，胡杨是较古老的树种，保留有大量的自然群体，因此，对胡杨的研究对于胡杨的保护和利用、林木育种和群体进化遗传学研究等方面都具有重要的意义。

本发明提供了一种胡杨的多重PCR检测方法并将结果用于胡杨群体的遗传结构研究和亲本-子代关系分析。

发明内容

本发明针对传统PCR方法耗时耗力的不足，提供了一种高效、便捷的对胡杨多个SSR位点进行扩增的引物和方法，实现一个反应扩增8个具有高多态性的SSR位点，为后续的群体遗传学分析和自然群体中的亲子代鉴定提供了重要的技术支持。

本发明中对体系的优化一方面涉及引物设计过程中对引物序列进行比对，减小引物之间配对和互补的几率，由此获得8对多态性高且两两不发生相互作用的引物。本发明还一方面是在实验中对各位点引物的浓度进行摸索，调整各引物组分之间的浓度，使各位点平衡而高效的扩增。本发明一方面调整DNA模板的浓度，避免过高或过低的模板浓度对实验结果的影响。本发明又一方面对PCR最适条件的摸索，尤其是对退火温度、循环数和延伸时间的优化。本发明还涉及上述各方面的任意组合。优选地，本发明具备上述各个方面的优化。

因此，本发明提供下述实施方案。

1、一种应用8重PCR进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的方法，其特征在于使用一组引物进行多重PCR反应，同时对8个位点进行扩增，所述引物由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成。

2、根据1所述的方法，其中，在所述引物中，正向引物的5’端分别用不同的荧光基团进行修饰，由此得到的结果用不同荧光标记，从而利于对结果进行分析。优选地，所述荧光基团包括Fam、Hex、Tamra和Rox。优选地，在所述引物为正向引物5’端用荧光基团Fam、Hex、Tamra或Rox修饰的引物，其由下述序列组成：

其中正向引物5’端的Fam，Hex，Tamra，Rox分别为荧光修饰基团，在结果中，Fam，Hex，Tamra和Rox分别对应的标记颜色为蓝色、绿色、黄色和红色。

3、根据1或2所述的方法，其中各引物扩增出条带片段大小分别为：

4、用于进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的引物组，其特征在于所述引物由序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的引物组成。

5、根据4所述的引物组，其特征在于，在所述引物中，正向引物的5’端分别用不同的荧光基团进行修饰，优选地，所述荧光基团包括Fam、Hex、Tamra和Rox。

6、根据4或5所述的引物组用于进行胡杨群体遗传分析和/或亲子鉴定的用途。