[发明专利]一种以抑制血管内皮细胞炎症为基础的具抗炎作用的腺病毒载体

说明书

技术领域

本发明涉及构建一种具有抑制炎症作用的表达持续激活型孕烷X受体(PXR/SXR)的可调控性腺病毒载体。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，作为疾病治疗的一种新手段，正受到越来越多的关注。1990年美国官方批准首例用基因方法治疗由ADA(Adenosine Deaninase)基因缺失引起的重度联合免疫缺陷病(SCID)，1992年Grossman等应用逆转录病毒载体将低密度脂蛋白受体(LDL-R)基因导入肝细胞成功治疗了一例家族性高胆固醇血症，开始了基因治疗在心血管疾病治疗中的研究。但迄今为止，美国食品药物监督局还没有通过认可任何用于人类基因治疗的产品，目前的基因治疗研究还都集中在实验研究和临床实验阶段。在基因治疗面临的主要问题是如何有效的导入外源基因和降低载体本身引起的免疫反应。

常用的基因导入载体主要分为非病毒载体和病毒载体两类。其中腺病毒载体具有包装容量大、宿主范围广、感染效率高同时不整合入宿主的基因组因而不会破坏宿主的基因等特点，是在基因治疗中最常用的病毒载体。但其外源基因表达时间短、免疫源性较强。近年来有很多研究集中于改造腺病毒载体，研究发现将腺病毒载体的基因组仅保留600bp左右，即只保留复制起始位点和包装信号仍然可以作为载体表达外源基因，这样改造后的腺病毒免疫原性也有一定程度的降低¹。

动脉粥样硬化及其所致冠心病、中风在我国及西方均已成为致死、致残的首要原因。根据Ross提出的“损伤-应答”(Response-to-Injury)学说²，动脉粥样硬化的发生是血管壁对循环中损伤因子伤害因子的反应及与血管局部血流动力学因素相互作用的结果。损伤因子造成血管内皮损伤及功能紊乱，炎性单核巨噬细胞募集、内膜下脂质沉积、修饰，由平滑肌及浸润的巨噬细胞吞噬，最终导致粥样斑块的形成。流行病学和临床研究表明血浆低密度脂蛋白水平升高、高血糖、高同型半胱氨酸、吸烟、缺乏运动等是动脉粥样硬化的独立危险因子，毒品和感染因子可能也参与动脉粥样硬化的发生及其进展。

血管的正常功能是依靠血管内皮细胞来保护的。但在高血糖、血脂紊乱、高血压、肥胖等因素的刺激下，通过启动过强的氧化应激反应，产生过量的自由基和炎症因子，可使血管内皮功能受到损伤³。血管内皮细胞是氧化应激和高血糖的重要作用靶点，内皮细胞激活是动脉粥样硬化的始动因素和早期阶段。人们逐渐认识到炎症在动脉粥样硬化中的作用，在人和实验性早期粥样斑块中发现了大量的白细胞，单核细胞和T淋巴细胞。正常内皮细胞并不结合白细胞，内皮细胞激活后ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等粘附因子及TNF-α、IL-8、IL-6等炎性细胞因子的表达上调。开发更为特异的抑制血管内皮细胞炎症作用的药物是防治动脉粥样硬化中的新策略。

孕烷X受体(Pregnane X Receptor，PXR)，是核受体超家族的成员之一，是一类配体依赖的转录激活因子，以内源性配体孕烷命名。PXR的主要生物学作用是解毒。最近有研究报道，PXR的激活可以抑制肝脏细胞的炎症反应⁴，也可以在动物体内抑制葡聚糖硫酸钠诱导的急性肠炎⁵。而PXR的激活在血管内皮细胞中的功能尚无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制血管内皮细胞炎症的表达持续激活型PXR(VP-PXR)的腺病毒用于基因治疗。

本发明所提供的腺病毒全称为四环素调控腺病毒表达持续激活型PXR(tet-off adenovirus expressing VP-PXR)。

附图说明

图1为Ad VP-PXR感染原代人脐静脉内皮细胞抑制TNF-α诱导的内皮炎症。

A为Ad VP-PXR在原代内皮细胞中的蛋白表达。

B为单核细胞黏附实验。

C为感染Ad VP-PXR后血管内皮细胞中粘附分子mRNA水平的变化。

D为感染Ad VP-PXR后血管内皮细胞中粘附分子蛋白水平的变化。

E，F为流式细胞分析感染Ad VP-PXR后血管内皮细胞表面粘附分子VCAM-1和E-selectin的蛋白表达水平变化。

图2为Ad VP-PXR抑制内毒素诱导的大鼠内皮粘附分子表达增高。

A为免疫荧光染色鉴定Ad VP-PXR在大鼠血管内皮中的表达。