[发明专利]一种禽网状内皮组织增生症病毒ELISA抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域提供了一种试剂盒，具体提供了一种禽网状内皮组织增生症病毒(REV)ELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotlleliosis，RE)是由禽反转录病毒属的网状内皮组织增生症病毒(REV)所引起的一组病理综合征，包括网状内皮组织细胞瘤、矮小综合征、淋巴肿瘤和其他组织的慢性肿瘤等。继禽马立克氏病和禽白血病之后，RE是迄今已经确定的禽类第三种传染性肿瘤病。最早的REV毒株是1958年从美国的一例患内脏淋巴瘤的火鸡脾脏中分离到的，经过在火鸡和鸡连续300次传代而获得的一株新病毒。

REV感染的自然宿主有火鸡、鸡、鸭、鹅等，可引起被感染禽的免疫抑制，干扰其他的免疫效应，导致免疫失败，并容易造成继发感染，使疫病的诊断和防控难度加大。现如今国内还没有有效的疫苗和药物来进行预防和治疗，对鸡群REV抗体水平进行检测，可确切了解鸡群抗体水平，进而了解感染状况，及时淘汰患病鸡，净化鸡群。随着我国养鸡业受到REV感染的危害日益严峻，研制REV血清抗体检测试剂盒的临床需求更加迫切。REV标准毒株SNV的env基因编码的gp90C末端表位位于感染细胞的表面，含有顺序和构象表位，是病毒的免疫显性蛋白，能够激发感染宿主产生中和抗体；因此REV的env蛋白被认为是一种应用于REV诊断的良好选择。

目前，国内外采用的REV病毒检测技术主要有：病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫组织化学、聚合酶链式反应(PCR)等。上述技术和方法虽然可以检测REV病毒或抗体水平，在实践中也取得了一定的效果。但均存在实验技术操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，成品昂贵等缺点，不宜用于临床检测。国内至今还未见REV抗体检测试剂盒的相关专利，国外特异性检测REV抗体检测试剂盒虽已经商品化，但由于昂贵，很难大范围使用。与现有的国外商品化试剂盒相比，本试剂盒的特异性更强、敏感性更高。

发明内容

本发明的发明人针对现有REV病毒检测技术存在的诸多不足之处，提供了一种禽网状内皮组织增生症病毒(REV)ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒主要包含有：预包被禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液、终止液、REV病毒阳性鸡抗血清和SPF鸡血清，其中所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的env蛋白，采用这种试剂盒特异性达100％；灵敏度为1∶700。本试剂盒用于对鸡群REV抗体水平进行检测，确切了解鸡群REV感染状况。

本发明的具体技术方案是：

所提供的试剂盒主要包含有：预包被禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液、终止液、REV病毒阳性鸡抗血清和SPF鸡血清，其中所述的囊膜蛋白是经过原核表达并纯化后的env蛋白；而且与常规试剂盒相比，本发明中应用的终止液为3moL/L的H₂SO₄溶液，主要原因是该终止液的使用可使结果由蓝色变为黄色，更易于人肉眼的观察。

其中试剂盒中的REV病毒阳性鸡抗血清和SPF鸡血清分别作为阳性对照和阴性对照，其均采用现有技术在严格的饲养条件下获得；

其中，所述的经过原核表达并纯化后的env蛋白，是通过如下方法获得的：

提取感染了直接从市场上(中科院微生物菌种库)购得的REV标准毒株SNV株的DFI细胞DNA，根据REV-env基因序列设计特异性引物：上游引物5’-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3’，其基因序列如Seq ID No：1所示，下游引物5’-CGACTCGAGAACAATATGAGCCCAAACA-3’，其基因序列如Seq ID No：2所示，并在引物中分别添加了EcoR I和Xhol I酶切位点，以PCR扩增出env基因，将env基因克隆入表达载体pET-28a质粒，得到了重组载体pET-28a-env重组质粒，使用0.2～0.3mmoL IPTG诱导表达出了带有His标签的融合蛋白His-env，其分子量约为45KD，更具体的为46.3KD，此蛋白以包涵体的形式存在，用8mol的尿素溶解包涵体，梯度尿素复性蛋白。

试剂盒中的其他组分中：