[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻病毒技术领域，具体地，涉及一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法。 

背景技术

毛雅元等（2010年）设计了2对引物，用套式PCR检测在VERO细胞上不同培养代次的猪流行性腹泻病毒的M基因，其扩增的片段仅有412bp，不能扩增不同培养代次的猪流行性腹泻病毒的M基因全部序列（681bp）。 

发明内容

为此，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因全长，特别是在ST、VERO细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的M基因全长。通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中M全基因的序列变化，从而通过M基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫效力的相关性。该方法扩增的目的片段长761bp，包含681bp的猪流行性腹泻病毒的M基因。 

本发明的技术方案如下：一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤： 

1、提取病毒RNA: 

取原病料即猪的水样粪便，经12000rpm离心5分钟后取上清液或者不同代次病毒的细胞培养液-20℃反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver.4.0(DV819A)提取病毒RNA; 

2、RT-PCR扩增 

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计RT-PCR引物，引物序列为： 

PEDVWF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3 

PEDVWR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3 

以步骤1所得的病毒RNA为模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScript one step RT-PCR Kit Ver.2（DRR055A）扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因，目的片段长867bp； 

3、套式PCR扩增 

依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因序列设计PCR引物，引物序列为： 

PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3 

PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3 

以RT-PCR产物为模板，用上述引物采用TaKaRa Premix Taq Version2.0(D334S)扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因片段； 

4、PCR产物的克隆及测序分析： 

（1）用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit(目录号EP101)对套式PCR产物进行纯化； 

（2）将纯化的PCR产物连接到pMD18-T Simple Vector上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。 

本发明的有益效果为：本发明所述猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的M基因全长，特别是在ST、VERO细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的M基因全长。通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中M全基因的序列变化，从而通过M基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫效力的相关性。该方 法扩增的目的片段长761bp，包含681bp的猪流行性腹泻病毒的M基因。 

附图说明

图1、将原病料、病毒在ST、vero细胞上培养的第5代、第10代、第15代毒的RNA分别用外围引物(PEDVWF/PEDVWR)扩增的RT-PCR产物以及其RT-PCR产物再用内部引物(PEDVNF/PEDVNR)扩增的套式PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。