[发明专利]一种荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫苗制备技术领域，具体涉及一种荚膜缺失型菌株马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗及其制备方法。

背景技术

马链球菌兽疫亚种是与动物粘膜和皮肤共生的一种细菌，尤其在马身上较常见，对许多其他种动物可能引起败血症、心内膜炎和关节炎，如牛、猪、羊、狗。在中国，马链球菌兽疫亚种是引起猪链球菌疾病的一个重要的病原体，1975年，在四川爆发猪链球菌流行性疾病，致300000头猪死亡，导致巨大的经济损失。到目前为止，我国养猪行业仍然受到这种疾病困扰。

马链球菌兽疫亚种对整个世界养猪行业构成严重威胁，但目前还没有有效的防治方法，因此研制有效疫苗预防马链球菌兽疫亚种感染是非常必要的。然而，关于这种病原的毒性因子研究太少，从而阻碍弱毒疫苗的研发，现有技术中研究较多的只有类M蛋白质（SzP）。最近，有研究者经过敲除编码SzP的基因成功构建了一个马链球菌弱毒疫苗株ΔATCC35246，并发现可以使得小鼠免受致死性攻击。这一研究成果给链球菌疫苗研究方向提供重要线索，为探索链球菌其他潜在的毒性因子作为弱毒疫苗靶标提供研究方向。

马链球菌可以合成由操纵子hasABC编码的透明质酸荚膜，通过对链球菌C55138菌株的hasB基因经过等位基因置换而使该基因失活，这直接便于研究透明质酸荚膜在该菌的发病机制中扮演的角色，同时研发相关的弱毒疫苗。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种荚膜缺失型菌株马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗。

本发明的另一目的是提供上述荚膜缺失型菌株马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗及其制备方法的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种荚膜缺失型菌株马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株，名称为马链球菌兽疫亚种C55138?hasB（Streptococcus equi subsp. zooepidemicus C55138?hasB），本发明中简称为突变菌C55138?hasB，于2012年5月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:　M 2012164，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

该突变菌C55138?hasB由于hasB基因功能缺失而不能正常合成荚膜，马链球菌可以合成由操纵子hasABC编码的透明质酸荚膜，而研究发现透明质酸荚膜在猪链球菌疾病的发病机制中扮演重要角色，因此这种荚膜缺失型突变菌会大大降低菌株本身的毒性。

上述荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株的制备方法，将hasB基因上下游各取部分基因连接到质粒pG⁺host5上，得到载体pG?hasB，转化马链球菌兽疫亚种C55138，利用同源重组原理将马链球菌兽疫亚种C55138基因组中的hasB基因缺失，构建成荚膜缺失型突变菌C55138?hasB。

作为一种优选方案，上述荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株的制备方法具体步骤如下：

（1）以马链球菌兽疫亚种C55138的基因组DNA为模板，SEQ ID NO:1~2所示核苷酸序列为引物，PCR扩增hasBL基因片段；

（2）以马链球菌兽疫亚种C55138的基因组DNA为模板，SEQ ID NO:3~4所示核苷酸序列为引物，PCR扩增hasBR基因片段；

（3）将所得的hasBL基因片段和hasBR基因片段连接入质粒pG⁺host5中，转化马链球菌兽疫亚种C55138，构建成荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株。

上述荚膜缺失型马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗株在制备疫苗中的应用。

一种马链球菌兽疫亚种弱毒疫苗的制备方法，具体步骤如下：

（1）马链球菌兽疫亚种C55138?hasB复苏于TSB中，37℃摇床培养过夜；

（2）取培养过夜的菌种于新的TSB中，37℃摇床扩大培养6~8h；

（3）经扩大培养的菌液在8000rpm条件下离心3min，去上清；

（4）沉淀中的细菌与灭菌的20wt.%脱脂乳混合，冷冻干燥，制备成冻干活疫苗。该冻干活疫苗可以在-20℃低温冰箱中保存。