[发明专利]基于基因芯片的水体中13种病原微生物同步快速检测方法

权利要求书

1.一种基于基因芯片的水体中13种病原微生物同步快速检测方法，所述方法是采用多重PCR同时扩增病原微生物的特异性基因片段，再通过基因芯片杂交和芯片扫描图像分析，获得检测结果；所检测的13种病原微生物包括：大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：

（1）水样处理

采集水样，用无菌塑料瓶封装，室温静置，取上清液加入浓缩仪进行浓缩集菌，然后抽干滤膜，取出放入离心管内，剪成细末状；

（2）DNA模板提取

采用E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit（D3350-01）试剂盒，或者具有同等作用的其他商业化DNA提取试剂盒提取样本的DNA，取10uL样本DNA进行下一步程序；

（3）多重PCR扩增目的片段

采用15μL的PCR体系，包括10×PCR Taq酶缓冲液1.0－2.0μL，浓度为2.5 mmol/L 的dNTP0.1－0.3μL，引物各0.4－0.8μL，浓度为10－20μmol/L，50×T-Taq DNA聚合酶0.1－0.5μL，DNA模板0.5－1.5μL，双蒸水补至15μL；所述引物是指13种病原微生物的引物；

PCR循环参数：95℃预变性3 min，接着作30个循环，每个循环包括94℃变性30s，68℃退火并延伸30s；循环结束后68℃延伸5 min；产物4℃保存备用；

（4）样本标记：

采用单碱基延伸标签反应（SBE-tags）进行；15μL的 SBE-tags反应体系含10×Reaction Buffer 1.0－2.0μL，SBE-tags引物（10－20μmol/L）0.4－0.8μL，浓度为10μmol/L 的Cy3-ddATP 0.1－0.5μL，活性浓度为5 U/μL 的Sequencing多聚酶 0.1－0.5μL，多重PCR纯化产物2－6μL，双蒸水补至15μL；循环参数：96℃预变性3min，接着作36个循环，每个循环包括96℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸20 s；循环结束后在72℃延伸5 min；

标记产物避光保存于4℃；

（5）芯片杂交与洗片

芯片杂交前使用预杂交液进行预处理1h以去除玻璃基片上多余的活性醛基基团，之后将SBE产物、荧光质控探针和杂交缓冲液加入，在48℃杂交2 h，杂交结束后洗片，除去芯片上未杂交上的成分；

（6） 芯片扫描，根据扫描结果，进行图像分析，判断样本中所含有的微生物种类。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述基因芯片可同时检测水体中13种致病微生物，芯片上同时含有阳性质控位点、阴性质控位点、以及空白对照等位点；所述芯片的所有探针在5’端均修饰有氨基。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述芯片在进行预杂交处理之后，进行荧光标记的样本杂交，杂交完成后洗涤、甩干，进行芯片扫描，分析扫描图像，确定样本中含有的微生物种类。