[发明专利]基于多重PCR的水中13种病原微生物同步快速检测方法

权利要求书

1.一种基于多重PCR的水中13种病原微生物同步快速检测方法，所述方法是采用多重PCR同时扩增13种病原微生物的特异性基因片段：大肠埃希菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、嗜肺军团菌、肠炎沙门菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺旋杆菌、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌和鼠疫耶尔森菌，再通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，实现对13种病原微生物同步快速检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

（1）水样处理

采集水样，用无菌塑料瓶封装，室温静置，取上清液加入浓缩仪进行浓缩集菌，然后抽干滤膜，取出放入离心管内，剪成细末状；

（2）DNA模板提取

采用E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit（D3350-01）试剂盒或者与之有同等作用的其他商业化DNA提取试剂盒进行核酸提取，取10uL样本DNA进行下一步程序；

（3）多重PCR扩增目的片段

采用15μL的PCR体系，包括10×PCR Taq酶缓冲液1.0－2.0μL，浓度为2.5 mmol/L的dNTP 0.1－0.3μL，浓度为10－20μmol/L的引物各0.4－0.8μL，50×T-Taq DNA聚合酶0.1－0.5μL，DNA模板0.5－1.5μL，双蒸水补至15μL；多重PCR循环参数：95℃预变性3 min，接着作30个循环，每个循环包括94℃变性30s，68℃退火并延伸30s；循环结束后68℃延伸5 min；4℃保存备用；13种病原微生物的检测分为三组多重PCR进行；上述引物是指权利要求1的13种病原微生物的引物；

（4）电泳检测

对三组多重PCR反应产物进行电泳观察，第一组产物的电泳图中含有5个不同长度的产物片段，分别为：志贺菌：113bp；金黄色葡萄球菌：283bp；肠出血性大肠杆菌O157:H7：366bp；大肠埃希菌：471bp；肠炎沙门氏菌：679bp；第二组产物的电泳图中含有4个不同长度的产物片段，分别为：单核细胞增生李斯特菌：155bp；嗜肺军团菌252bp，肺炎克雷伯菌319bp；幽门螺旋杆菌364bp；第三组产物的电泳图中含有5个不同长度的产物片段，分别为：结合分枝杆菌：135bp；鼠疫耶尔森菌：184bp；炭疽芽孢杆菌：275bp；霍乱弧菌：465bp；16S：370bp；其中16S做为检测结果的阳性质控。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中的电泳检测使用3%琼脂糖凝胶。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）的浓缩仪采用Milliflex Plus微生物过滤系统。