[发明专利]肠炎沙门氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用

权利要求书

1.一种肠炎沙门氏菌标准样品，其特征在于：通过以下方法制备：

I.基因组核酸的提取

①肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC：13076，经菌株活化、增菌培养；

②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4℃离心15min；

③吸弃上清，取沉淀1~3mL，加pH8.0的TE溶液10mL悬浮，加0.5mL浓度为100g/L SDS和50μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h；

④加2mL浓度为5mol/L NaCl，混匀，加1.5mL CTAB-NaCl混合溶液，混匀，65℃温浴20min；其中，CTAB-NaCl混合溶液为100g/L CTAB和0.7mol/L NaCl；

⑤取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；

⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；

⑦取上清，加上清0.6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心10min；

⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL pH8.0的TE溶液溶解，获得肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC：13076基因组核酸溶液；

⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥；

Ⅱ.冷冻干燥

①样品预冻：先把步骤Ⅰ所得的核酸样品在-80℃低温冷冻2h；

②冷冻过程：干燥室制冷，温度降至-35℃时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40℃时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0.5Torr时，结束冷冻过程；

③样品干燥：干燥室温度设置为15℃，当真空度降至0.1Torr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)ATCC：13076基因组核酸标准样品，置于-20℃中避光贮存。

2.一种非应用于疾病诊断目的的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)的检测试剂盒，其特征在于，包括肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)检测基因和阳性标准对照品，

Ⅰ.肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)检测基因，至少包括下述a或b中的一种：

a:肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特异片段invA基因PCR引物：

正向引物：SEQ ID NO：1

反向引物：SEQ ID NO：2

b:肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)中的特异片段的Real-Time PCR引物和探针序列：

正向引物：SEQ ID NO：3

反向引物：SEQ ID NO：4

探针：SEQ ID NO：5

Ⅱ.所述的阳性标准对照品是权利要求1所述的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)标准样品。