[发明专利]谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法

权利要求书

1.一种谷氨酸钠生物固相酶催化合成γ-氨基丁酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）生物合成：将底物谷氨酸钠溶液与固相酶催化合成生成γ-氨基丁酸溶液，当谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸的转化率≥99%时，离心或过滤使反应液与固相酶分离，得γ-氨基丁酸水溶液；     

（2）分离纯化：生成的γ-氨基丁酸溶液经过阳离子交换树脂，除去反应液中的氯化钠，最后稀氨水洗脱置换游离γ-氨基丁酸；

（3）脱色浓缩：氨基丁酸水溶液活性炭脱色后，赶氨，真空薄膜浓缩，浓缩至γ-氨基丁酸含量230～240g/100ml，得γ-氨基丁酸浓溶液；

（4）结晶干燥：γ-氨基丁酸浓溶液加入95%酒精，析出γ-氨基丁酸白色沉淀结晶，离心分离，真空干燥得γ-氨基丁酸白色粉末。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在生物合成工艺中，所述底物谷氨酸钠摩尔浓度为100～1000mmorl/L。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述底物谷氨酸钠与固相酶的配比为100～1000mmorl谷氨酸钠与1～10万生物效价的固相酶。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：在生物合成工艺中，所述合成的底物溶液pH值为3.5～7.5；合成反应温度为25～55℃；反应液滤液与活性炭的重量配比为：100∶1～5；所述的γ-氨基丁酸浓溶液与95%酒精的体积比为1∶5～10；结晶干燥的过程为在10万级洁净环境下进行。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于所述固相酶由如下工艺制备：

（A）谷氨酸脱羧酶的基因克隆及表达：

根据短乳杆菌ATCC 367的谷氨酸脱羧酶（GAD）的基因序列设计以下引物：引物一：AATGCATATGGCTATGTTATATGGTAAACACACGCAT 和引物二：AATTGAAGCTTAGTGAGTGAATCCGTATTTTTTAGG，引物一和引物二分别含有内切酶位点Nde I和Hind III，利用引物一和引物二根据Bio-Rad公司的iProof DNA聚合酶的说明书扩增谷氨酸脱羧酶的基因片段，扩增片段经前述内切酶消化后，连接到前述内切酶预消化的载体pRSET-A（Invitrgen，美国）上成为质粒pRSET-A GAD，该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌种中表达，将转化的菌落转移到50毫升LB培养液，37摄氏度振荡培养16小时，离心收集细胞，大生产时，将发酵体积扩大至吨级规模，管式离心机连续离心收集菌体；

（B）酶的纯化与固定化：

GAD的纯化与固定化：取菌体细胞以4倍体积的磷酸缓冲液（20mM, pH7.4）悬浮，800bar高压破碎两次，加5M磷酸钾溶液（pH7.0）至终浓度为1.2M，缓慢搅拌下加1%聚丙烯酰胺及氯化钙溶液使结絮，板框过滤或高速离心去渣，清液为酶粗提物溶液，测定蛋白含量；以每10mg蛋白/克载体的量向酶溶液加入环氧型固相酶载体，室温缓慢搅拌24小时，弃上清，所得固相酶分别以20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）、含1M 氯化钠的20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）及20mM醋酸盐缓冲液（pH5.5）洗涤，最后，测定固相酶的活性。