[发明专利]一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及重组双歧杆菌，具体涉及一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌及其制备方法和应用。

背景技术

手足口病是一种由肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71)引起的常见传染病,被喻于二十一世纪的“脊髓灰质炎”，手足口病主要传染源是带病毒者和轻型散发病例，患者咽喉分泌物、唾液，疱疹液、粪便中均含有病毒，可通过人的消化道、呼吸道和分泌物密切接触等途径传播，其多种的传播途径及目前尚无有效的疫苗预防决定了EV71病毒容易引起暴发性流行，因此开发有效的疫苗是手足口病防治中最为紧迫的问题之一。

EV71病毒是小RNA病毒科肠道属的成员，流行范围遍及全球，1974年Schmidt等首次报道从美国加利福尼亚爆发的神经系统疾病患者中分离得到EV71。EV71核酸为单股正链RNA，基因组编码4个外壳蛋白，即VP1、VP2、VP3和VP4，4个蛋白通过拼装呈原聚体和亚单位，最终形成病毒外壳，VP1、VP2、VP3暴露在病毒表面，VP4则包埋在病毒外壳内侧起连接作用。EV71病毒抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上，其中VP1蛋白集中了重要的T细胞和B细胞免疫表位，具有重要的功能特点，该蛋白是目前疫苗研究的主要靶蛋白。综合多项研究表明VP1蛋白在肠道能够诱导EV71的特异性保护免疫作用，这一结果提示肠道制剂表达VP1蛋白可能能用于EV71感染的免疫预防。

近年通过非致病细菌表达蛋白制备口服疫苗已成为热点研究方向之一。但在EV71上的研究却没有先例。

发明内容

为了解决目前手足口病防治中的问题，本发明公开了一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌。

本发明的第二个目的在于公开了由所述重组双歧杆菌组成的治疗EV71的疫苗。

本发明的第三个目的在于公开了所述重组双歧杆菌的制备方法。

本发明的第四个目的在于公开了所述重组双歧杆菌在制备治疗EV71药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌，其中，所述重组双歧杆菌为转化入外源载体的双歧杆菌，所述外源载体为含VP1蛋白编码序列的载体；本技术方案中的VP1 蛋白编码序列如序列表4所示，所编码的VP1蛋白如序列表5所示。

上述技术方案中所述的重组双歧杆菌，其中，所述含VP1蛋白编码序列的载体为pBAD-VP1载体。

上述技术方案中所述的重组双歧杆菌，其中，所述pBAD-VP1载体由pBAD/S载体和EXS-(His)₆-VP1基因连接组成。

上述技术方案中所述的重组双歧杆菌，其中，所述pBAD/S载体由pBAD/gIII和重组双链E.SOD序列连接组成。

上述技术方案中所述的重组双歧杆菌，其中，所述重组双链E.SOD序列由T7启动子和双链E.SOD序列的编码序列组成，其序列如序列表1所示。

一种治疗EV71的疫苗，所述疫苗包括活性成分和药学上可接受的载体，其中，所述活性成分为上述技术方案中任一技术方案所述的重组双歧杆菌。

一种制备EV71疫苗的重组双歧杆菌的制备方法，包括下述步骤：

(1)、对重组双链E.SOD序列和pBAD/gIII载体分别进行酶切，用连接酶将重组双链E.SOD序列连接入双酶切后的pBAD/gIII载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆，测序鉴定，得到pBAD/S载体；所述重组双链E.SOD序列由T7启动子和双链E.SOD序列的编码序列组成；

(2)、人工合成双链EXS-(His)₆-VP1基因，对pBAD/S载体进行双酶切，将双链EXS-(His)₆-VP1基因插入双酶切后的pBAD/S载体中，转化大肠杆菌后获得阳性克隆pBAD-VP1载体；

(3)、将pBAD-VP1载体转化双歧杆菌，筛选pBAD-VP1转化阳性的双岐杆菌，即得制备治疗EV71疫苗的重组双歧杆菌。

上述技术方案中所述的制备方法，其中，步骤(1)中对重组双链E.SOD序列和pBAD/gIII载体分别用BstI1071酶进行酶切，用T4连接酶进行连接；步骤(2)中对pBAD/S载体用BpiI酶和XbaI酶进行双酶切，用T4连接酶进行连接。

上述技术方案中所述的制备方法，其中，将pBAD-VP1载体转化双歧杆菌后用含氨苄西林的MRS 固体培养基进行筛选。

上述技术方案中所述的重组双歧杆菌在制备治疗EV71药物中的应用。