[发明专利]从烟草克隆细胞色素P450基因

说明书

此案是申请日为2004年10月15日、中国申请号为200480030387.X、发明名称为“从烟草克隆细胞色素P450基因”的发明申请的分案申请。

本发明涉及在烟草(Nicotiana)植物中编码细胞色素P450酶(下文称为P450和P450酶)的核酸序列和使用那些核酸序列来改变植物表型的方法。

背景技术

细胞色素P450催化各种化学上不同的底物的酶反应，包括内源性和异源底物的氧化、过氧化和还原性代谢。在植物中，p450参与包括植物产物合成在内的生化途径，所述产物例如是苯丙素(phenylpropanoids)、生物碱、萜类、脂质、生氰糖苷(cyanogenic glycoside)和葡糖异硫氰酸盐(glucosinolates)(Chappel，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.198，49:311-343)。细胞色素p450也称为血红素-硫醇盐蛋白(heme-thiolate protein)，通常用作多组分电子转移链(称为含p450的单加氧酶系统)中的末端氧化酶。所催化的特定反应包括脱甲基化、羟基化、环氧化、N-氧化、磺基氧化(sulfooxidation)、N-、S-和O-脱烷基化、脱硫作用、脱氨基作用和偶氮基、硝基和N-氧化物基团的还原。

烟草植物p450酶的各种作用涉及产生各种植物代谢物，例如苯丙素、生物碱、萜类、脂质、生氰糖苷、葡糖异硫氰酸盐和其它化学物质的宿主。近年来，人们开始了解一些p450酶影响植物中植物代谢物的组成。例如，长期以来人们希望通过育种改变植物的所选脂肪酸的特性来改善特定植物的风味和香味；然而涉及控制这些叶子组成的水平的机理知之甚少。下调与改变脂肪酸有关的p450酶可有助于积累提供更适宜的叶子表型质量的所需脂肪酸。p450酶的功能及其在植物组成中广泛的作用仍有待发现。例如，特定类型的p450酶发现可催化脂肪酸分解为挥发性C6-和C9-醛和醇，而主要是这些物质导致水果和蔬菜具有“新鲜翠绿”的气味。可改变其它作为新目标的p450酶的水平，通过改变烟草叶子中的脂质组成和相关的降解代谢物来提高叶子组成的质量。叶子中的几种这些成分受老化的影响，而老化刺激叶子质量特性的成熟。其它人也报道p450酶在改变涉及植物病原体相互作用和疾病抗性的脂肪酸中起作用。

在其它例子中，已提示p450酶涉及生物碱的生物合成。降烟碱是在烟草(Nicotiana tabaceum)中发现的少量生物碱。推测它是这样产生的：p450介导的尼古丁脱甲基化，然后在N位酰化和亚硝基化，从而产生一系列N-酰基降烟碱(N-acylnonicotine)和N-亚硝基降烟碱。推测的p450脱甲基酶催化的N-脱甲基化被认为是烟草中降烟碱生物合成的主要来源。尽管认为该酶是微粒体酶，但是迄今为止未能成功地纯化尼古丁脱甲基化酶，也未能分离到有关基因。

此外，有假说认为(但未证实)p450酶的活性受遗传控制并且也强烈地受环境因素的影响。例如，当植物达到成熟阶段后，认为烟草中尼古丁的脱甲基化作用大大增加。另外，有假说认为(还未证实)脱甲基化基因含有当存在时能抑制RNA翻译的转座元件。

在本发明之前，p450酶形式的多样性、其结构和功能的不同使得对烟草p450酶的研究十分困难。此外，对p450酶的克隆至少部分由于这些膜定位的蛋白通常存在量低且经常在纯化中不稳定而受阻。因此，需要在植物中鉴定p450酶和与那些p450酶相关的核酸序列。特别是，在烟草中仅有少许细胞色素p450蛋白已见报道。本文所述的发明发现了许多细胞色素p450片段，这些片段基于它们的序列同一性而对应于几组p450种类。

概述

本发明针对植物p450酶。本发明还涉及来自烟草的植物p450酶。本发明也涉及其表达由乙烯和/和植物老化诱导的植物中的p450酶。本发明还涉及植物中具有酶活性的核酸序列，例如可分类为氧化酶、脱甲基酶等和其它酶，以及使用那些序列来使这些酶的表达降低和沉默和过度表达。本发明也涉及在含有较高降烟碱水平的植物而非显示较低降烟碱水平的植物中发现的p450酶。