[发明专利]白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及白蚁内源木质纤维酶重组杆状病毒的构建方法。

背景技术

生物质能是通过植物的光合作用把太阳能以化学能形式在生物质中储存的一种能源形式，是重要的可再生能源。上世纪以来，随着现代工业的快速发展和世界人口的激增，当前人类正面临着能源和石油危机的严峻挑战。

乙醇作为高效、环保的燃料及添加剂在社会生产及居民生活中发挥着不可替代的作用，大力发展乙醇，逐步取代汽油作为主要能源势在必行。目前，燃料乙醇的生产主要依靠粮食作物，但粮食作物资源很难满足日益增长的能源需求，与宝贵的粮食资源不同，木质纤维原料是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。木质纤维原料中纤维素及半纤维素约占干重的60-85%，纤维素、半纤维素经酶学降解生产单糖是公认的最理想的的转化方法。因此，纤维素酶和半纤维素酶的研究一直是生物学领域的重要课题之一。

自然界微生物对木质纤维的降解是一个缓慢的过程，虽然对木质纤维有较完整和彻底的降解能力，但降解效率却并不高，使之成为木质纤维材料利用的限速步骤和瓶颈环节。而白蚁由于自身对生长养分来源的需求，其自身从咀嚼器官、消化管到酶系、共生微生物群落等，都为木质纤维素的降解提供了最为高效的机制，白蚁内外源木质纤维酶的开发被认为是大量转化和利用木质纤维生物能源的重要参考途径。因此，以白蚁作为模式生物，对其木质纤维降解体系进行研究已成为近年来的学术热点。

在研究白蚁内源木质纤维酶的过程中仍存在着许多问题有待解决，其中与传统微生物产纤维素、半纤维素酶的克隆表达不同，白蚁内源木质纤维酶区别于细菌、真菌内源酶，是一种昆虫内源酶，其合成后修饰系统区别于大肠杆菌、酵母菌等传统表达体系，而目前的研究主要集中于利用传统微生物表达体系进行酶的克隆、表达，利用这种传统微生物表达体系进行白蚁内源木质纤维酶的克隆和表达，很难保证表达产生的酶蛋白具有原始活性。因此，在白蚁内源酶蛋白表达过程中，需要一种接近白蚁自身蛋白表达加工的高效表达体系。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有白蚁内源木质纤维酶的蛋白表达很难保证具有原始活性的问题，而提供白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法。

本发明的白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法是按以下步骤进行的：

一、参照GenBank中发表的黑翅土白蚁（Odontotermes formosanus）的EG酶的基因序列，设计引物P1和P2，以黑翅土白蚁cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，并与pMD18-T载体进行连接，获得p18EG1；

二、用HindⅢ和EcoR Ⅰ对pFastBac1转移载体和步骤一获得的p18EG1分别进行双酶切，分别回收双酶切后的pFastBac1转移载体和双酶切得到的EG基因的目的条带，将回收的EG与pFastBac1进行连接，连接产物经鉴定后获得pFBEG1；

三、将pFBEG1转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，以100ng重组Bacmid DNA为模板，以P1和P2为引物，进行PCR扩增，将含有F基因的重组Bacmid命名为Bacmid-EG；

四、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid-EG转染sf9细胞，获得重组杆状病毒BVEG1，即完成白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac表达载体的构建；其中，步骤一和步骤三中所述的引物P1序列均为5’-ACATTCCACTTCAGAAGACGTC-3’；引物P2为5’-TGCAGAGGACGAATTCCTTTA-3’。

本发明的有益效果：

本发明利用PCR获得白蚁内源纤维素酶EG基因片段，将其连入到质粒载体pMD18-T多克隆位点中，获得重组质粒，经转化、蓝白筛选后获得重组质粒p18EG1，经PCR及酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR、酶切结果与预期结果相符，利用酶切连接的方法将EG基因片段转入pFastBack1质粒中，转化筛选后获得pFBEG1重组质粒，转染昆虫细胞后，获得带有白蚁内源纤维素酶基因的重组杆状病毒。