[发明专利]一种利用线粒体分子标记快速鉴定缢蛏群体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种缢蛏种质鉴定，具体说，涉及一种利用线粒体分子标记鉴定缢蛏群体的方法。

背景技术

缢蛏是我国四大海产养殖贝类之一，具有生长快、养殖周期短、易管理、产量高、效益好等养殖特点。据统计，我国贝类的养殖产量占海水养殖总产量的82%。滩涂贝类的年产量近200万吨，其中缢蛏的产量就已经达到了70万吨，约占我国滩涂贝类养殖总产量的30%，在我国海水养殖中占有重要的地位。

例如，我国浙江和福建一带沿海是缢蛏的重要苗种产区，被运输到其他沿海城市进行养殖和销售。近几年，随着缢蛏养殖规模的不断扩大，江苏和上海沿海滩涂也逐步开始引种养殖。异地苗种引进和养殖容易导致异地苗种与土著苗种的混杂，因此如何区分不同地区苗种以期进行后期苗种选择，种质资源保护和良种选育工作成为重要的课题。由于不同群体缢蛏表型相近，且容易受到环境因素的影响，因此依靠表型进行群体鉴别具有相当困难。线粒体属于母系遗传，变异速度较快，采用线粒体分子标记进行缢蛏群体的鉴别是非常可靠的分子生物学方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用线粒体分子标记鉴定缢蛏群体的方法，该方法可靠性高。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案是：

一种利用线粒体分子标记快速鉴定缢蛏群体的方法，该方法包括以下步骤：

（1）采集缢蛏个体，提取DNA；

（2）合成线粒体细胞色素氧化酶I标记引物；

（3）对缢蛏群体的线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因进行PCR扩增；

（4）对PCR产物进行纯化；

（5）对纯化的PCR产物进行测序和序列比对。

在本发明的一优选实施例中，步骤（1）中，所述标记引物为：

Sc-COI-F：5’GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’；

Sc-COI-R：5’TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AATCA 3。

在本发明的一优选实施例中，步骤（2）中，所述PCR扩增程序为：

（a）94℃预变性3min，进行35个循环：

（b）94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸50s；

（c）最后72℃延伸10min。

在本发明的一优选实施例中，步骤（2）中，所述PCR扩增所用反应体系为25μL，含10×Buffer 2.5μL，Mg2+2.0mmol/dm3，dNTP0.2mmol/dm3，TaqDNA聚合酶1U，上、下游引物各0.2μmol/dm3，模板DNA50-100ng。

本发明的方法，鉴别方法简单，可靠性强。

附图说明

图1是缢蛏江沪群体和浙闽群体的线粒体分子标记细胞色素氧化酶I（COI）序列。

其中“*”表示江沪群体和浙闽群体的保守位点，“●”表示鉴别江沪群体和浙闽群体的碱基位点，JSSc,SHSc,ZJSc和FJSc分别表示江苏，上海，浙江和福建缢蛏个体。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明。

实施例1：利用本发明的方法，对缢蛏江沪群体和浙闽群体进行鉴别。

（1）采集江苏、上海、浙江和福建沿海滩涂的缢蛏个体，提取DNA；

在我国江苏、上海、浙江和福建沿海滩涂随机采集缢蛏个体。利用解剖刀和镊子分别收集四个地区的缢蛏个体的外套膜组织，置于无水乙醇中保存备用。

采用酚氯仿抽提法进行DNA抽提，具体方法如下。每个样本取0.5g外套膜组织剪碎后，加入500μL组织匀浆缓冲液（10mmol/dm3 Tris-Hcl，PH=8.0;50mmol/dm3 EDTA，PH=8.0），混匀后加入终浓度为1%的SDS和200μg/cm3的蛋白酶K，55℃消化澄清。利用饱和酚抽提1次，然后利用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)提取2次，再次利用氯仿：异戊醇(24：1)抽提1次，最后加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤两遍后干燥，无菌水溶解DNA。紫外分光光度计测定样品DNA的OD260、OD280值，确定其浓度和纯度，母液置于-20℃保存。

（2）合成线粒体细胞色素氧化酶I(COI)引物；

线粒体细胞色素氧化酶I(COI)引物的合成，采用固相亚磷酰胺三酯法，由DNA合成仪合成引物碱基序列，通过PAGE法纯化引物。