[发明专利]一种检测苯甲酸雌二醇的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

一种检测苯甲酸雌二醇的酶联免疫试剂盒，属于免疫分析技术领域。

技术背景

2008年的三聚氰胺事件，使三鹿集团倒闭，我国乳品企业重新洗牌，使人们对牛奶及其制品质量安全问题愈发关注。2010年8月某奶粉疑致女婴性早熟的激素门事件又将乳制品推上了风口浪尖。牛奶中是否有雌激素的存在和奶牛产奶数量是否受到雌激素的作用是目前人民大众急需了解的内容。无论是进口奶源，还是国内奶源，均有残留激素的隐患。奶业和食品营养专家指出，奶牛吃的饲料或草料含有激素的可能性最大，在奶粉业这是一种隐形的存在；此外，在奶牛饲养中使用的催产素、催奶素等，也可能导致激素残留。尤其近年来由于过量使用外源性性激素作为动物饲料添加剂和植物生长调节剂，导致大量食品中污染了性激素类物质。这些雌激素残留，通过食物链在人体内积累，可诱发癌变，对生殖与神经等系统带来影响，还造成严重的环境问题。

虽然国家在2008年制定了《乳品质量安全监督管理条例》，要求加强奶畜养殖、生鲜乳收购、乳品生产、经营、进口等各环节的监督检查，明确规定禁止销售、收购和加工尚处于用药期和休药期内的奶畜产，不符合健康标准或者没有经过检疫合格的奶畜产的，以及不合法规标准的生鲜乳，从源头上控制生鲜乳的兽药残留。但是目前雌激素的检测尚未列入国标中，乳制品企业也未将其作为生鲜乳收购的检测项目，因此尚不能从源头上消除雌激素的隐患。

要减小雌激素污染对食品安全和人体健康造成的威胁，必须加强市场监管，完善检测手段。而乳制品中雌激素的残留量一般较少，常规测定方法的应用受到限制，需要比较灵敏的检测方法。目前苯甲酸雌二醇的检测方法主要使用大型仪器，如HPLC、GC-MS、LC-MS等。但由于仪器设备价格昂贵，操作复杂、费时，不适用于大批量样品的快速检测，因此不能用于大批量样品的现场快速筛查，不能在基层单位和企业得到推广。而酶联免疫分析(ELISA)法，由于其特异性强、灵敏度高、操作简便、检测速度快，特别适于大批量样品的现场快速检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前在真菌毒素、藻毒素等的快速检测中ELISA法已经是最常用的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测苯甲酸雌二醇的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，用于对食品中苯甲酸雌二醇的检测。

本发明的技术方案：该检测苯甲酸雌二醇的试剂盒是由(1)96或48孔包被板，(2)苯甲酸雌二醇标准品，(3)苯甲酸雌二醇的单抗冻干品，(4)酶标记的羊抗鼠抗体冻干品，(5)洗涤液，(6)显色液A，(7)显色液B，(8)终止液所组成。

所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为HRP-羊抗鼠抗体冻干品，洗涤液为含有吐温的Tris-HCl缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇水溶液，终止液为硫酸溶液。

本发明主要采用酶联免疫分析法(ELISA)来检测苯甲酸雌二醇。采用ELISA的技术主要有两个方面：第一，特异性单克隆抗体的制备，利用抗原免疫小鼠，经细胞融合、选择培养、腹腔注射，经培养后抽取腹水，得到抗苯甲酸雌二醇的单克隆抗体；第二，苯甲酸雌二醇-ELISA试剂盒的制备。

检测苯甲酸雌二醇的酶联免疫分析试剂盒的制备详见实施例1和2。

苯甲酸雌二醇的测定方法为：取包被有苯甲酸雌二醇与载体蛋白偶联物的微孔包被板，加入苯甲酸雌二醇标准或处理好的样品到各自的微孔中，再加入苯甲酸雌二醇抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，暗处静置后加终止液，在450nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的苯甲酸雌二醇含量。

本发明的有益效果：该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，检测限可达10ng/mL，特别适于大批量样品的现场快速检测。

附图说明

图1为苯甲酸雌二醇酶联免疫分析法的标准曲线。

具体实施方式

提供以下实施例是为了更好地理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。

实施例1抗苯甲酸雌二醇的单克隆抗体的制备

苯甲酸雌二醇是典型的半抗原，在免疫反应中只具有反应原性，需与大分子物质结合后才有免疫原性。我们采用多元酸酐法活化苯甲酸雌二醇，用混合酸酐法将活化的苯甲酸雌二醇与载体蛋白(KLH，BSA)偶联，制备了免疫抗原苯甲酸雌二醇-KLH和包被抗原苯甲酸雌二醇-BSA。以合成的苯甲酸雌二醇-KLH作为人工合成的免疫抗原进行动物免疫，制备抗体。