[发明专利]基于固相合成的多肽的切割法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域，具体的是基于固相合成的多肽的一种切割方法，是根据肽序中氨基酸的不同而选用不同的切割液并能洗脱出多肽的一种切割方法。

背景技术

多肽（polypeptide）是α－氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，也是蛋白质水解的中间产物，简称为肽。由两个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫做二肽，同理类推还有三肽、四肽、五肽……一直到九肽。通常由10～100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽。它们的分子量低于10，000Da（Dalton道尔顿），能透过半透膜，不被三氯乙酸及硫酸铵所沉淀。

多肽有生物活性多肽和人工合成多肽两种。生物提取的多肽具有很强的活性，所以叫做活性肽。只有活性肽才能对人体产生很好的效果。但是人工合成的多肽有很多是没有活性的，是需要筛选的，只有活性肽才能被人体安全使用。

人体的很多活性物质都是以肽的形式存在的。肽涉及人体激素、神经、细胞生长和生殖各领域，是涉及人体内多种细胞功能的重要物质，是人体重要的生理调节物，具有重要的生物学功能。肽对生命的存在非常重要。

多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，总的来说分成两种：固相合成和液相多肽合成。1963年，Merrifield首次提出固相多肽合成方法（SPPS），这是在多肽化学研究上具有里程碑意义的合成方法。Merrifield经过反复筛选，放弃了苄氧羰基（Z）在固相上的使用，发明了将叔丁羰基（BOC）用于保护ɑ----氨基并在固相合成上进行使用。1972年，Lou Carpino首先将9-芴甲氧羰基（FMOC）用于保护ɑ----氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除且反应条件温和，因而得到广泛使用。

多肽固相合成顺序一般从C端（羧基端）向N端（氨基端）合成，涉及多步反应，其原理是按照所需要的肽序将各种氨基酸连接起来合成一个生物大分子——多肽。在合成过程中通过将要合成肽序末端氨基酸的羧基适当连接分子键合于不溶性高分子树脂上，并用结合在固相载体上的氨基酸作为组分，再经过脱去氨基酸保护基与过量的活化羧基组分反应连接长的肽序，达到所需的多肽，然后再选择适当的切割液去除侧链保护基和从树脂上裂解的产物。

现有对侧链保护基及树脂的切割方法——标准氢氟酸（HF）切割法，其步骤包括：

A、将多肽树脂倒入离心管中，再向离心管中加入切割液：

肽序中含半胱氨酸(Cys)的多肽选用由HF/苯甲醚/二甲基硫(DMS)/苯甲硫醚构成的切割液，它们的比例为10:1:1:0.2；

肽序中不含半胱氨酸的多肽选用由HF/苯甲醚/二甲基硫构成的的切割液，它们的比例为10:1:1；

B、经过一段时间的反应后再通入氮气以蒸发HF和DMS；

C、用三氟乙酸(TFA)吸取切除下的多肽；

D、将树脂与多肽通过负压作用从砂芯漏斗中分离出来，然后在离心管中倒入足量的乙醚析出粗品多肽；

E、将乙醚与多肽摇匀于离心管中使其成为溶液；将离心管放入离心机使肽得以沉淀；复用乙醚清洗多肽以洗掉切割液获得较为纯净的肽；

F、去掉最后一遍洗涤多肽的乙醚，将离心管的盖子旋紧放入干燥器用油泵抽干乙醚。

现有HF切割法的不足之处是：

（1）氢氟酸（HF）是一种酸性极强、具有高毒性的物质，一旦吸入HF气体将危害人体甚至导致人员死亡，HF气体的溢出会对环境造成严重污染。

（2）HF具有强腐蚀性，不可在玻璃仪器中进行多肽的切割，须在特殊材料的仪器中进行实验。

（3）用HF切割多肽的操作难度大，因此必须在能耐强腐蚀的通风橱中进行；操作员必须佩戴眼罩、防毒面具、耐腐蚀橡胶手套等防护装备。

（4）用HF切割后使用氮气蒸发HF和DMS增添了操作的复杂性。

（5）反应中可能带有氨基酰化等副反应参与。

发明内容

本发明为解决上述问题，提供一种基于固相合成的多肽的切割法，所述的多肽为基于BOC法或FMOC法合成的多肽，本切割法主要是根据肽序中氨基酸的不同而选用不同的切割液并能方便地洗脱出多肽的一种切割方法，能获得低污染、高产量的多肽。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下。

一种基于固相合成的多肽的切割法，所述的多肽为基于BOC法或FMOC法合成的多肽，其特征是，包括以下步骤：

（1）配制切割液

首先，配制三种浓度不同的切割液：