[发明专利]一种转化头孢菌素C的基因工程菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种高效转化头孢菌素C的基因工程菌及其制备方法。

背景技术

近些年来，头孢菌素以其高成长性和良好的临床表现，在全球抗感染药物市场上占有越来越多的市场份额。我国的头孢菌素产业自上世纪80年代起已经得到了长足的发展，近几年的发展更是日新月异。作为重要的β-内酰胺类抗生素，头孢菌素类抗生素已经由第一代发展到现在的第四代。20世纪70年代初7α-甲氧头孢菌素被发现，这标志着对β-内酰胺类药物的研究已经进入了新的纪元。

甲氧基头孢菌素是指棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)发酵产生的头霉素C(Cephamycin C)经半合成制得的一类以头孢烯为母核，在β-内酰胺环上的C7位有一个反式甲氧基的头孢菌素。这类抗生素又称头霉素类抗生素(Cephamycins)。甲氧基的存在阻止内酰胺环与酶分子的接近，增强药物对β-内酰胺酶的稳定性，并提高对厌氧菌的活性，使本类抗生素具有较强的耐β-内酰胺酶性能，对一些产生β-内酰胺酶的细菌有较强的抗菌作用。由于结构上的差异，它比头孢菌素C的活性高，与其他头孢菌素相比，其优点尤为显著。

甲氧基头孢菌素已有多种产品上市，包括头孢米诺、头孢美唑等。这类药物共同的半合成中间体为甲氧基头孢菌素。甲氧基头孢菌素的合成一般可以通过化学合成法和微生物转化法。化学法是目前业内普遍采用的方法，存在有机溶媒使用量大，能耗严重等问题。文献报道利用棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus，ATCC27064)的粗酶液能够将头孢菌素C转化为甲氧基头孢菌素C，但转化率较低。我们通过倍增棒状链霉菌中的cmcJ基因，试图提高转化头孢菌素C生成甲氧基头孢菌素的效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的转化头孢菌素C为甲氧基头孢菌素C菌株转化效率低的问题，提供转化头孢菌素C的效率更高的基因工程菌及其制备方法。

头孢菌素C转化为甲氧基头孢菌素C的过程中，头孢菌素C首先被羟基化酶转化为羟基化头孢菌素C，再由甲基化酶转化为甲氧基头孢菌素C，但是野生型的棒状链霉菌对于头霉素C的转化效率较低。因此，本发明将转化过程中的一个关键基因cmcJ，作为外源基因插入棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)野生型菌株的基因组中，并使它高效表达，发现得到的棒状链霉菌突变株对于甲氧基头孢菌素C转化效率有所提高，同时中间产物羟基化头孢菌素C的转化率提高更为显著，可见cmcJ基因成功插入到棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的染色体上并得到表达，完成了本发明。

本发明的第一个目的是提供一种转化头孢菌素C的基因工程菌，其是在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)野生菌株的基因组中整合有转化头孢菌素C的一个关键基因cmcJ的表达盒的工程菌，所克隆的cmcJ基因的核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的第1203-2271位所示的序列，其中cmcJ基因的编码序列是SEQ ID NO.2的第1257-2189位所示的序列。

在基因组中整合入外源基因的表达盒，从而使插入的外源基因表达是现有技术，一般是让该外源基因用启动子转录，终止子终止转录即可。本发明中整合了含有红霉素抗性基因启动子和cmcJ基因编码序列的表达盒。

启动子可以启动基因的转录，从而使基因表达。强启动子的启动效率更高。因此，根据本发明一个优选的实施方式，所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在棒状链霉菌中启动转录的启动子，优选红霉素抗性基因启动子，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1第1-469位所示的序列。

根据本发明一个优选的实施方式，所述的cmcJ基因是来源于棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)。

根据本发明一个优选的实施方式，所述的基因表达盒在棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)野生菌株的基因组中的整合位点是attB位点。

本发明中，所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)野生菌株可以是任何Streptomyces clavuligerus属的野生菌株，都可以达到本发明的效果，优选棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus ATCC27064。

本发明的第二个目的是提供一种重组载体，其含有红霉素抗性基因启动子和cmcJ基因编码序列的表达盒。