[发明专利]鼠源DCF1特异性多克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

    本发明涉及了一种新的鼠源DCF1特异性多克隆抗体及其制备方法。

技术背景

树突状细胞因子（dendritic cell factor 1，DCF1）又名跨膜蛋白59（transmembrane protein 59，TMEM59），首先发现于免疫系统的树突细胞中，是一个表达范围比较普遍的单次跨膜蛋白。根据UniProt对其的注释信息，DCF1主要定位在高尔基体上。目前对于该蛋白的功能研究报道还比较少，其功能可能与物质的运输相关，已有报道和文章表明DCF1与其同源蛋白TMEM59-like能够抑制淀粉样前体蛋白APP向细胞膜的转运以及进一步的剪切，而APP与阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）的形成相关，说明DCF1与神经退行性疾病存在某种联系。

根据目前已有的信息， DCF1商品化的相关抗体只有抗人的多克隆抗体，虽然其说明上指出也能抗鼠源的DCF1，但是在实际应用中发现这种识别效果非常不好；而抗鼠源DCF1商品化的抗体还没有。随着DCF1研究的深入，相关功能的报道肯定会越来越多，而且为了深入研究，必然会借助一些模式动物如小鼠、果蝇等。所以，制备一种新的抗鼠源DCF1的特异性抗体进行后续研究具有迫切性。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种鼠源DCF1特异性多克隆抗体。

本发明的目的之二在于提供该克隆抗体的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鼠源DCF1特异性多克隆抗体，其特征在于所述的特异性多克隆抗体是将SEQ ID NO:2的第44位到76位氨基酸残基组成的多肽特异性结合。

上述的特异性多克隆抗体是将SEQ ID NO:2的第44位到76位氨基酸残基对应的cDNA序列构建到原核表达质粒pGEX-4T-1中，得到重组质粒pGEX-4T1-59a，再将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到可溶表达带有鼠源DCF1第44位到76位氨基酸残基的多肽融和蛋白。

上述的特异性多克隆抗体是将多肽融和蛋白作为抗原免疫动物而获得。

一种制备上述的鼠源DCF1特异性多克隆抗体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.对DCF1氨基酸序列进行了蛋白跨膜结构预测，其中第1到239位氨基酸为胞外段结构；

b.用PCR处于胞外段第44到76位氨基酸残基对应的cDNA，重组入pGEX-4T-1中，构建成pGEX-4T1-59a载体；

c.将载体转化到BL21(DE3)中，原核可溶表达表达得到包含目的DCF1多肽的可溶性融合蛋白；

d.将融合蛋白为抗原免疫动物燥，得到以上述制备的蛋白，按照多抗免疫方案进行动物免疫，得到特异性多克隆抗体。

利用Western Blot和Immunohistochemical技术对制备得到的多克隆抗体进行特异性评测。同时利用制备的上述多克隆抗体检测小鼠乳腺癌细胞4T1及正常小鼠乳腺组织DCF1的蛋白表达情况，发现4T1中DCF1的表达高于正常组织。为了更加确认这种结果，通过在4T1细胞的培养基中JNK inhibitor II，而JNK信号通路已被证实与多种疾病相关，因此，JNK被认为是可以调节疾病状态细胞恢复到正常状态的一个潜在靶点。当4T1细胞受到JNK inhibitor II的抑制后，出现增殖速度变慢这种癌细胞状态发生改变的现象，再通过上述制备的多克隆抗体检测DCF1的表达变化后发现，DCF1在4T1中的表达量随着其癌细胞状态受抑制程度的加深而降低。用该抗体能检测到小鼠乳腺癌细胞4T1与正常的小鼠乳腺组织中DCF1的表达差异，将4T1的癌细胞状态通过JNK inhibitor II抑制后，通过制备的多克隆抗体也检测到了DCF1的蛋白表达减少，说明制备的多克隆抗体可以用来检测小鼠乳腺癌不同状态下DCF1的表达水平。

附图说明

图1为TMHMM Server v.2.0预测的DCF1跨膜结构

图2为扩增的抗原序列cDNA片段及重组质粒pGEX-4T1-59a经BamHI和 SalI双酶切的电泳图（A-扩增到的抗原序列cDNA片段；B-重组质粒pGEX-4T1-59a酶切产物），说明目的片段已经插入到pGEX-4T-1载体中。