[发明专利]用于分离和鉴定Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性引物

说明书

技术领域

本发明涉及用于分离和鉴定玉米Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性引物。

背景技术

玉米是全球第一大粮食作物，是全世界主要的粮食来源。我国玉米的总产量已超过小麦，成为仅次于水稻的第二大粮食作物。而且玉米长期以来都是一种遗传模式植物。玉米B73基因组的序列测定已经完成，这将加快玉米方面的科学研究。预计在玉米中至少存在3.2万个基因，这些基因的克隆和功能分析已成为下一个重要的挑战。在众多基因克隆的方法中，插入突变研究一种非常有效的手段。主要包括T-DNA插入突变和转座子插入突变。由于转基因技术的限制，在玉米中很难应用T-DNA插入法进行插入突变分析。但是在玉米存在内源的转座子是很好的进行插入突变研究的工具。目前在玉米中最主要的用于创建插入突变体的转座子是Mutator（Mu）和Activator/Dissociator（Ac/Ds）两个系统。Mu因子具有转座频率高，正向突变率高和全基因组范围插入的特点，目前在国内外已有几个较大规模的Mu插入突变体库，并以用于玉米分离和克隆玉米基因。Ac/Ds虽然其转座频率较Mu转座子低，但其在玉米基因组拷贝数低，倾向于向连锁位点转座和倾向于插入低甲基化的基因富集区，近年来被作为与Mu互补的系统广泛的用于构建插入突变体库和进行基因的定向插入突变分析。

在分离鉴定转座系和利用转座子标签法克隆基因的过程中，分离转座子的侧翼序列是一个重要的环节。传统的分离Ac/Ds侧翼序列的方法是以Ac或Ds的部分序列作为探针，通过Southern杂交来鉴定在每一个转座系材料中所对应的特异条带，然后回收特异条带区域的DNA并进行分子内的自连接，再通过反向PCR的方法来扩增特异条带，最后将侧翼条带测序并验证。这种方法对DNA的需要量大，而且做Southern和反向PCR是耗时费力的方法，难以提高实验效率。因此建立操作简单、快速高效的Ac/Ds侧翼序列分离和鉴定方法对于Ac/Ds插入突变体的鉴定和利用转座子标签法进行基因克隆都具有重要的意义。

Siebert等利用一种部分双链的接头连接到经过酶切的平末端的DNA片段上，然后利用接头引物和基因特异性的引物通过嵌套PCR扩增基因上游或下游的序列。由于在接头的短链的3’末端用氨基封闭，减少了由于接头引物单独扩增带来的非目的条带，从而提高了PCR产物的特异性。Ji和Braam利用产生3’突出端的内切酶酶切基因组DNA，然后利用在引物的3’端带有与突出末端互补碱基的接头引物和基因特异性引物扩增，这种方法中省去了连接的步骤，进一步提高了实验的效率。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种用于分离Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性引物。

本发明的目的之二在于提供利用该特异性引物分离Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列的方法。

本发明的目的之三在于提供一种用于鉴定上述Ac/Ds转座子侧翼序列是Ac还是Ds的侧翼序列的特异性引物。

本发明的目之四在于提供利用该特异性引物区分鉴定Ac和Ds转座子侧翼序列的方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于分离Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性引物， 其特征在于该引物为：

a.用于分离Ac/Ds 5’端侧翼序列的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：7所示的碱基序列；

b.用于分离Ac/Ds 3’端侧翼序列的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：14所示的碱基序列。

一种分离Ac/Ds转座子侧翼序列的方法，采用上述的特异性引物，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.取10～15株植株的DNA等量混合后，进行限制性内切酶酶切，得到酶切产物；

b.对于步骤a所得酶切产物，如是平末端产物，则连接平末端接头后，选择一种相应的Ac末端特异性引物和接头引物进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物；

c.将步骤b所得的PCR扩增产物经稀释后作为模板，再用第二轮Ac末端特异性引物和接头引物进行第二轮PCR扩增，得到Ac/Ds转座子侧翼序列。

d.对于步骤a所得酶切产物，如是3’突出末端产物，则选择一种相应的Ac末端特异性引物和RSE接头引物进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物；

e.将步骤d所得的PCR扩增产物经稀释后作为模板，再第二轮Ac末端特异性引物和RSE接头引物进行第二轮PCR扩增，得到Ac/Ds转座子侧翼序列。