[发明专利]一种在Ti表面固定载VEGF的肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒的方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及纳米颗粒制备技术和无机材料表面改性技术，特别涉及人工器官材料钛表面的生物化改性方法。

背景技术

钛(Ti)基金属材料因其良好的生物相容性已广泛应用于生物医学领域，但对于一些特殊应用的领域，如作为心血管植入材料用于心血管疾病的治疗，其生物相容性还远未达到临床要求。这主要是由于钛材料血液相容性较差，且对于血管内膜增生及炎症反应等并无抑制作用。

通过对材料表面进行生物化改性，赋予材料良好的抗凝血能力和再内皮化能力是改善其生物相容性的有效方法。肝素(Hep)是一种临床常见的抗凝血药物，且肝素可与多种内皮细胞相关的生物因子结合，延长生物因子在体内的半衰期，促进内皮损伤修复。此外，也有研究报道肝素在炎症的预防和治疗中也具有良好的效果。VEGF(血管内皮生长因子)是一种血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，对于血管内皮细胞的增殖迁移以及内皮祖细胞的动员、归巢及向内皮细胞的分化均起着重要作用。

多巴胺(DM)是一种生物体内的神经传导物质，在溶液条件下可发生自聚反应。DM发生自聚的同时，部分儿茶酚基团可与金属或金属氧化物形成配位结合，从而在材料表面沉积一层聚DM层。得到的聚DM层具有二次反应性，其氧化得到的邻二琨基团能够与伯氨基(-NH₂)、仲胺基(-NH)发生西弗碱反应或麦克尔加成反应。

Hep与多聚赖氨酸(PLL)可通过静电交互作用组装成纳米颗粒，利用VEGF与肝素间的相互作用可将VEGF装载于颗粒中，形成载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒。该种颗粒在材料表面的固定可有效改善材料的血液相容性，促进内皮损伤修复。而目前尚无将载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒固定于钛材料表面的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒的制备方法及其在Ti材料表面的固定方法，通过该方法对Ti材料表面进行生物化改性可有效提高材料的血液相容性和细胞相容性。

本发明实现以上目的采用的技术方案是，一种在Ti表面固定载VEGF的肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒的方法，其步骤为：

A、样品制备。在抛光的纯Ti表面沉积聚多巴胺涂层，待用；

B、载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒的制备。将浓度为50-500ng/ml的VEGF溶液(PBS，pH 7.4)等体积滴加至浓度为5-20mg/ml的肝素溶液(PBS，pH 7.4)中，37℃静置1-3h。然后在室温和磁力搅拌条件下，将Hep和VEGF混合液等体积滴加至浓度为0.2-1mg/ml的PLL(MW 15-30万)溶液(PBS，pH 7.4)中；

C、纳米颗粒固定。将A步骤中沉积有DM的Ti片浸泡于B步获得的纳米颗粒悬液中，在15-50℃振荡条件下反应6-24小时，分别用PBS和双蒸水漂洗，干燥后即得目标物。

本发明的反应过程与机理主要分为两个部分。第一部分为载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒的制备。首先通过Hep与VEGF的相互作用使VEGF与Hep结合；其次在pH＝7.4的PBS体系中，载有VEGF的Hep溶液与呈正电性的PLL溶液进行混合后可发生静电交互作用，通过分子间静电结合及分子缠绕作用，即可形成具有纳米尺寸的载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒。第二部分为纳米颗粒在Ti材料表面的固定。首先将Ti浸泡于DM的Tris溶液中，DM中的儿茶酚基团与Ti可形成配位结合，并在有氧条件下交联聚合，从而在Ti表面形成一层牢固的DM层。得到的DM聚合层具有二次反应性，其氧化得到的邻二琨基团可与DM中的伯氨基(-NH₂)发生麦克尔加成反应和西弗碱反应，从而形成多层聚DM层；其次，纳米颗粒中PLL上的氨基也可与聚DM层表面的邻二琨结构发生麦克尔加成和西弗碱反应，从而将纳米颗粒共价固定在Ti表面。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

一、创造性的制备出载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒，利用聚DM层能与伯氨基发生麦克尔加成和西弗碱反应的特性，可将富含氨基的纳米颗粒共价固定在DM涂覆的Ti表面。通过该种方法，可以有效提高VEGF的装载量，延长VEGF的半衰期，增强其内皮损伤修复效果。同时也可增强肝素及VEGF与材料的结合强度，降低药物损失率，延长药物作用时间。

二、纳米颗粒的制备工艺及固定方法均简单易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，效果显著。