[发明专利]一种草鱼出血病抗原蛋白及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物蛋白制备技术领域，更具体涉及一种草鱼出血病抗原蛋白，同时还涉及一种草鱼出血病抗原蛋白的制备方法，还涉及一种草鱼出血病抗原蛋白在制备草鱼出血病疫苗中的应用。

背景技术

草鱼（Grass carp，Ctenopharyngodon idellus）是我国重要的淡水养殖鱼类之一，在我国淡水养殖中占重要地位。草鱼饲料来源广、生长速度快，肉质鲜美，深受广大养殖者和消费者喜爱。但是，草鱼病害多、养殖成活率低，妨碍了草鱼养殖业的发展。草鱼出血病是一种严重危害草鱼鱼种的病毒性疾病，其流行范围广、传播速度快，死亡率高，每年都对草鱼养殖业造成巨大的经济损失。长期以来，草鱼出血病的防治技术研究一直是我国水产养殖病害防治技术研究的重要内容，草鱼出血病防治技术的研究不仅具有重要的理论意义，而且具有广阔的应用前景。

草鱼出血病的主要病原为草鱼呼肠孤病毒。目前，市场上没有草鱼用草鱼出血病疫苗，但已申请一些相关专利，例如，中国发明专利申请200410060881.2公开的一种草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备，是采用草鱼肾细胞系即CIK细胞增殖草鱼呼肠孤病毒；通过离心法，对感染了草鱼呼肠孤病毒的细胞病毒悬液进行纯化和浓缩；表面活性剂处理纯化的病毒，使完整病毒结构解体，形成病毒核酸与衣壳蛋白亚单位组分；采用核酸酶消化，降解游离的病毒基因组dsRNA；通过透析处理，得到不含核酸的草鱼呼肠孤病毒蛋白抗原亚单位制剂。又如中国发明专利申请201110189906.9公开的一种草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，是采用sf9昆虫细胞增殖重组草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆状病毒(vAcGCRV-VP5/VP7)；经冻融裂解重组病毒感染的sf9细胞，采用蔗糖层离心法分离重组蛋白组分，由此得到纯化的体外表达VP5和VP7蛋白复合物；通过将纯化的VP5和VP7蛋白进行鱼体保护实验，证实其具有良好的免疫保护作用。但亚单位疫苗由于制备工艺复杂、成本高、难以广泛推广应用。

寻找一种工艺简单、成本低，易于广泛推广的草鱼出血病疫苗对维护国家安全，保证食品安全、环境安全，促进草鱼养殖业可持续发展具有重要意义。

发明内容：

本发明的一个目的在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒，草鱼呼肠孤病毒GCRV-104，CCTCC NO:V201217，于2012年4月18日提交保藏。

草鱼呼肠孤病毒颗粒是呈5：3：2对称的正二十面体，直径范围在55-80nm，具有双层衣壳，无囊膜，该病毒粒子对酸碱（pH3-10）及高温处理有一定的抗性，对氯仿和乙醚不敏感，56℃处理半小时仍具有毒力，但处理一小时后则病毒感染力明显下降。草鱼呼肠孤病毒粒子在CsCl及蔗糖密度梯度离心中的浮力密度为分别为1.37g/cm³和1.305g/cm³，沉降系数为550S。因为该病毒核心可合成RNA聚合酶，且该酶最适温度为28℃，所以草鱼呼肠孤病毒的流行具有季节性。草鱼呼肠孤病毒104株在CIK细胞中病变明显，约接种24h后开始出现病变，接种5-6天时病变达90%。与草鱼呼肠孤其他株不同，草鱼呼肠孤病毒GCRV-104株在CIK中不出现网状卷起等病变，而是细胞变圆、变亮既而脱落。

本发明的另一个目的在于提供了一种草鱼出血病抗原蛋白，本发明草鱼出血病抗原蛋白是草鱼呼肠孤病毒VP6重组蛋白，草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白能产生抗原反应，但却并不具有致病性，其使用较现有技术更为安全。

本发明还有一个目的是在于提供了一种草鱼出血病抗原蛋白的制备方法，工艺简单、成本低，易于广泛推广的草鱼出血病疫苗，特别是大量工程化生产。

本发明还有一个目的是提供了一种草鱼出血病抗原蛋白在制备草鱼出血病疫苗中的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种草鱼呼肠孤病毒GCRV-104，其制备过程是：