[发明专利]一种微藻蛋白组的分析方法

权利要求书

1.一种微藻蛋白组的分析方法，其特征是包括如下步骤：

（1）微藻细胞收集：

取出已培养好的微藻藻液样品，在3000-5000rpm，4℃条件下离心3-4min，收集下层的细胞，用水清洗细胞后，在3000-5000rpm，4℃条件下离心3-4min，收集下层的细胞在-80℃下冷冻干燥4-6h获得冻干细胞；

（2）提取细胞内蛋白质：

①从冻干细胞中取4份，每份50-100mg，分别置于离心管中，每管加入0.5-1mL细胞裂解液，混匀，以每超声8-10s，间歇5-6s的方法冰上间歇超声破碎共40-60s；加入5-15μL的质量比为2-4:1的DNase I/RNase A酶混合溶液，混匀，4℃静置反应10-30min；加入5-15μL80-120mM的苯甲基磺酰氟异丙醇溶液，4℃静置1-3h；12000-15000rpm离心25-40min；取上清，得到蛋白溶液；所述细胞裂解液为：8M尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mM的Tris，余量为水；

②测定蛋白浓度：

采用Bradford试剂盒，将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度加入考马斯亮蓝G-250溶液中，配制成系列溶液，测定系列溶液在595nm处的吸光值，建立标准曲线；按相同方法测定步骤①获得的4份蛋白溶液蛋白的浓度；

③沉淀蛋白

分别取4份步骤②获得的蛋白溶液，每份蛋白溶液中含50-150μg蛋白，每份加入蛋白溶液体积4-6倍的-20℃--40℃的丙酮，沉淀12-20h；离心，弃上清，沉淀用-20℃--40℃的体积浓度为70%-85%的丙酮水溶液洗涤；冷冻干燥备用；-80℃贮存；

④蛋白还原以及酶解

向步骤③所得的4份干燥蛋白中，每份添加10-40μL 40-60mM的三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；

加入1-4μL三（2-羧乙基）膦，在50-60℃反应1h，对各个蛋白进行还原化处理；然后加入1-2μL甲基硫代磺酸甲酯，室温反应10-15min，终止还原反应；加浓度为0.2-0.3μg/μL的胰蛋白酶水溶液20-30μL，37℃反应12-18小时，进行蛋白酶解；

⑤肽标记

在每个蛋白酶解液中分别加入一管用60-80μL乙醇溶解的iTRAQ标记试剂，室温反应1h；

⑥溶液混合

将步骤⑤获得的4份溶液混合成混合液，于-40℃保存；

（3）差异表达蛋白鉴定

将步骤（2）⑥中得到的混合液，进行二维液相-Q-Tof质谱测定，进行定性和定量处理，得到微藻蛋白组分析结果。

2.根据权利要求1所述的一种分析微藻蛋白组的方法，其特征是所述微藻为小球藻（Chlorella sorokiniana）、栅藻（Scenedesmus obliquus）、集胞藻（Synechocystis sp.PCC6803）及鱼腥藻（Anabaena sp.PCC7120）。

3.根据权利要求1所述的一种分析微藻蛋白组的方法，其特征是所述步骤（3）二维液相-Q-Tof质谱的检测条件为：

①一维强阳离子交换柱分离：

色谱柱：ZORBAX BIO-SCX II强阳离子交换柱，3.5μm，35×0.3mm；

流动相：体积比为95/5/0.1的水/乙腈/甲酸；

流动相流速：10μL·min^-1；

②二维C18柱分离：

色谱柱：ZORBAX 300SB-C18trap柱5μm，5×0.3mm；

ZORBAX 300SB-C18柱3.5μm，150mm×75μm；

流动相配比：流动相A：体积比为95/5/0.1的水/乙腈/甲酸；流动相B：体积比为95/5/0.1的乙腈/水/甲酸；

流动相流速：300nL·min^-1；

③质谱条件：

离子化方式：正离子电喷雾模式；

电压：1500V；

离子源温度：150°C；

扫描范围：70~2500m/z。