[发明专利]一种RET融合基因的筛查方法

说明书

技术领域

本发明属于医药和生物技术领域，涉及RET融合基因的筛查方法，尤其是RET融合基因筛查的多片段引物及其应用。

背景技术

现有技术公开了Ret蛋白是在神经元发育及细胞增生、分化、迁移中发挥重要作用的受体酪氨酸激酶。其编码基因RET位于人类10号染色体长臂，并在肿瘤学中具有重要意义。已知RET基因容易在其11号内含子发生断裂，断裂后RET基因的3’残端可以与KIF5B、CCDC6或NCOA4等多种“伙伴基因”发生融合，形成“RET融合基因”，并产生相应的融合蛋白。

研究显示，RET融合基因常见于约2％的肺腺癌、20％的甲状腺乳头状癌等实体型肿瘤，并被研究证明是造成这些肿瘤发生发展的“驱动突变”。根据WHO的全球肿瘤统计进行估算，全球每年新发的具有RET融合基因的实体肿瘤可能超过万例。但幸运的是，这些具有RET融合基因的肿瘤患者可以通过接受RET靶向药物来延长其生命和提高生活质量。因此，对于肿瘤中RET融合基因的筛查，有助于进一步明确病情，帮助患者选择相应有针对性的治疗方案，提高疗效，延长生命。

目前关于RET融合基因的具体形式多达16种以上，例如KIF5B-RET、CCDC6-RET等形式。这些复杂的融合形式，使得对RET融合基因的筛查具有较高难度。现有技术中对RET融合基因的筛查方法主要包括如下两种主要形式：1、普通PCR，通过设计引物，对某一种具体的融合形式进行扩增，根据琼脂糖凝胶电泳判断结果；2、荧光原位杂交(FISH)，通过荧光标记的DNA探针特异性地与肿瘤组织DNA中RET基因5’端和3’端进行杂交，在荧光显微镜下判读结果。

临床实践显示，目前所述的普通PCR筛查方法，其存在有以下明显缺陷：由于RET融合基因的具体形式多大16种以上，因此至少需要设计16对PCR引物，分别进行16次PCR反应，费时费力；而且，如果样本是一种新的RET融合形式(具有未知的“伙伴基因”)，则使用该方法则无法有效地进行检测，而出现假阴性的结果。对于荧光原位杂交(FISH)，虽然目前被认为是诊断融合基因的金标准，但是其价格高昂，实验步骤复杂，对操作人员的技术水平要求极高，致使其亦无法进行推广。因此，目前临床实践中需要提出更加简单、方便、灵敏的RET融合基因的筛查工具和筛查方法。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术所存在的缺陷与不足，提供一种新的RET融合基因的筛查方法，尤其涉及RET融合基因筛查的多片段引物及其应用。

本发明提供了筛选RET融合基因的real-time PCR联合引物。

本发明的进一步目的是提供上述real-time PCR联合引物在RET融合基因筛查方法中的应用，本发明方法能准确、简捷、经济、直观地判断RET融合基因存在与否。

本发明的RET融合基因筛查方法，以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入real-time PCR联合引物，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有RET融合基因。本方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。

具体而言，本发明提供的一种RET融合基因筛查方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)设计筛查RET融合基因的5对real-time PCR联合引物或探针；

(2)提取样本中的总RNA；

(3)以样本中的总RNA为模板，通过逆转录方法合成cDNA；

(4)在5个real-time PCR反应单位中，以(3)中所得的cDNA为模板，分别加入(1)中设计的5对引物或探针，以及包括荧光染料在内的反应预混液；

(5)在real-time PCR反应仪上进行real-time PCR反应，并分别记录每个样本的10个反应单位的荧光阈值(Ct值)；

(6)分别计算引物I～III所在反应体系的Ct值的均值Ct_ABP，和引物IV～V所在反应体系的CT值的均值Ct_BBP；

(7)计算ABP与BBP之差的绝对数，如大于4，则认为该样本具有RET融合基因。