[发明专利]用于基因工程的载体、缓冲液及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地，涉及用于基因工程的一种新型载体、一种新型缓冲液及它们的使用方法。

背景技术

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计，在体外构建重组DNA分子，然后导入受体细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品等。

此外，基因工程还为研究基因和基因组结构与功能提供了最基本的手段，已成为生命科学中不可缺少的基本研究方法，在许多方面都有重要应用，包括但不限于：基因组组织结构研究、基因表达研究、重组蛋白生产、转基因生物、基因治疗、药物筛选、动植物的抗逆性等。

在经典的基因工程实验中，通常包括以下主要步骤：

1.选择受体细胞和载体

尽管有许多种受体细胞和载体在使用，但绝大多数实验是从E.coli实验菌株和质粒克隆载体起步的。由于其技术完备、通用性强、获取容易，E.coli和质粒载体早已成为本领域的首选。但是，如果要克隆的DNA特别大，例如数十万碱基对或更大，在需要使用细菌人工染色体或酵母菌人工染色体（hizuya H,Birren B,Kim UJ等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(18):8794-7）。

2.准备载体和目的片段DNA

在经典的基因工程研究中，为了把目的片段克隆到载体上，载体DNA和目的DNA应当用适当的限制性内切酶（下称内切酶）酶切从而产生匹配的末端以便把目的DNA连接到载体上。内切酶的选择要考虑载体和目的片段能产生互相匹配的末端。在经典基因工程实验中，这一过程是用相同的内切酶或内切酶组合分别切割载体DNA和目的片段实现的。如果用平端内切酶、单个粘性末端酶或同尾酶处理载体，还需要用碱性磷酸酶对载体进行处理，以防止载体自连。

无论是用粘性末端酶还是用平端酶切酶，处理过的载体都要经过纯化以去除对后续的连接等过程有影响的成分。

两个非同尾酶（例如BamHI和EcoRI）切割DNA分子产生的片段末端不互补，因此不能自连。在经典基因工程操作中，带有两个不能自连的非同尾末端的载体是最普遍使用的。

用内切酶切割上述来源的DNA使其产生可与前述准备好的带粘性末端或平末端的载体相匹配的末端。目的片段上没有与载体相匹配的位点时，可以通过添加接头（Brown,Terry(2006).Gene cloning and DNA analys is:an introduction（基因克隆和DNA分析：介绍）。剑桥，马萨诸塞州；布莱克韦尔出版社ISBN 1-4051-1121-6和Russell,David W.;Sambrook,Joseph(2001).Molecular cloning:a laboratory manual（分子克隆：实验室手册）。冷泉港，纽约；冷泉港实验室）或通过PCR使其两端带上适当的酶切位点。

3.制备重组DNA分子

用上述预处理过的载体和目的片段制备重组DNA分子是通过多个简单的分子生物学步骤完成的。其中，最主要的是连接反应。即把上述准备的合格载体和目的DNA片段按一定比例混合，加入DNA连接酶和相应的缓冲液，保温一定时间后带有匹配末端的两个DNA片段就可以连接成重组DNA分子。

在基因工程研究中，DNA连接酶是一种常用工具酶，它可以把两个具有匹配末端的DNA分子连接成重组DNA分子。基因工程实验中常用T4DNA连接酶。

4.把重组DNA分子导入受体细胞

把重组DNA分子导入受体细胞的方法有多种，其名称因所用实验过程而异。这些方法包括但不限于本领域技术人员熟知的转化、转导、转染和电击等（Brown,Terry(2006).Gene cloning and DNA analysis:an introduction（基因克隆和DNA分析：介绍）。剑桥，马萨诸塞州；布莱克韦尔出版社ISBN 1-4051-1121-6和Russell,David W.;Sambrook,Joseph(2001).Molecular cloning:a laboratory manual（分子克隆：实验室手册）。冷泉港，纽约；冷泉港实验室）。

5.筛选带有载体序列的细胞