[发明专利]一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的引物组及方法有效
| 申请号： | 201210157397.6 | 申请日： | 2012-05-18 |
| 公开（公告）号： | CN102649980A | 公开（公告）日： | 2012-08-29 |
| 发明（设计）人： | 王兴红;黄峰;侯欣;李红叶 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/645 |
| 代理公司： | 杭州天勤知识产权代理有限公司 33224 | 代理人： | 胡红娟 |
| 地址： | 310027 浙*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 pcr 检测 叶点霉属 真菌 引物 方法 | ||
1.一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的引物组，其特征在于，包括四对引物：
第一对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；
第二对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；
第三对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；
第四对引物：上游引物的碱基序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。
2.一种巢式PCR法检测叶点霉属真菌的方法，包括：
（1）提取待测菌的DNA；
（2）以提取的DNA为模板，利用真菌通用引物ITS4/ITS5进行第一轮PCR扩增；
（3）将第一轮PCR扩增得到的产物稀释50-100倍，以稀释后的产物为模板，利用权利要求1所述的四对引物进行第二轮PCR扩增；
（4）将第二轮PCR扩增产物进行凝胶电泳分离、染色，根据扩增条带判定待测菌的种类。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的真菌通用引物ITS4/ITS5在第一轮PCR扩增反应体系中的终浓度为0.2-0.3mmol/L。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的真菌通用引物ITS4/ITS5在第一轮PCR扩增反应体系中的终浓度为0.25mmol/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的第一轮PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环；最后72℃延伸10min。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的四对引物在第二轮PCR扩增反应体系中的终浓度分别为：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的四对引物在第二轮PCR扩增反应体系中的终浓度分别为：
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的第二轮PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min;94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行34个循环；最后72℃延伸10min。
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