[发明专利]A、O和C型口蹄疫病毒的试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对牛和猪以及相关牛和猪的产品是否感染特定的传染病进行检测的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。确切讲是本发明是一种检测牛和猪以及相关牛和猪的产品是否感染A、O或C型口蹄疫病毒的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是一种由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)引起的危害牛、羊等偶蹄动物的严重的急性热性高度接触性传染病。由于其传播速度快，不易控制和消灭，严重危害世界动物贸易，被世界卫生组织列为必须上报传染病之一。

口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科(picornaviridas)中的口蹄疫病毒属(aphthavirus)。共包括A、C、O、Asia I、SAT I、SAT II及SAT III型7个血清型，各血清型之间无交叉保护力。FMDV的病毒粒子直径20-25nm，为正二十面体结构，近似圆形；基因组为全长8500(nt)的正链RNA，包括一个开放阅读框(open reading frame，ORF)，5’-非编码区(5’-Untraslated Region，5’-UTR)和3’-非编码区(3’-Untraslated Region，3’-UTR)；ORF编码病毒多聚蛋白，依赖于自身编码的蛋白酶(L、2A、3C)及少数的宿主因子，在经过3级裂解后，形成4种病毒结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和9种非结构蛋白(Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)；四种结构蛋白各60分子构成病毒颗粒，VP1靠近由五个原粒组成病毒表面的小洞，VP2和VP3位于远端，VP4则完全位于衣壳里面。

尽管目前国内外对口蹄疫的病原学、血清分型、诊断做了大量的研究，但口蹄疫病毒几乎遍及世界各地，口蹄疫对偶蹄类经济动物的威胁众所周知，它的发病率和造成的经济至今仍为各类传染病之首。2004年，台湾爆发的口蹄疫导致了600万头猪被屠宰，直接和间接经济损失到120亿美元。在畜牧兽医方面，它也威胁着多种家畜和很多野生动物的繁衍和生存。O型和A型口蹄疫基本呈世界性分布，Asia 1在我国曾经流行，到目前已经60年没有发生，科研人员倾向于其可能已经在中国灭绝，SAT I、SAT II及SAT III型主要存在于非洲，C型口蹄疫流行范围相对较小，但对我国威胁较大。由于口蹄疫血清亚型众多，毒力相差很大，所以在临床症状差别较大。尤其口蹄疫与猪水泡病、水泡性口炎等类似症状的病毒，在临床上很难区分，而且临床症状和病理变化因感染动物的种类、年龄、病程长短及感染毒株毒力等不同而有所差别，可能缺乏特征病症，这给口蹄疫的诊断和防治带来极大困难。因此，单靠临床诊断难以定性。快速简单的实验室诊断方法是确诊口蹄疫唯一有效地途径。随着分子生物学技术的快速发展，口蹄疫诊断技术的研究不断取得新的进展，为口蹄疫病毒核酸序列分析创造了条件。

为了确定口蹄疫是否在某一地区存在，检测动物血清抗体的方法并非完全可靠，还必须通过通过病原学检测以确诊病原的存在，一般检测方法为生物学实验、血清型诊断技术和分子生物学技术等诊断技术，但是这些方法有的敏感性不高、有的特异性不强、有的检出率较低，即使病毒分离技术被认为是检测口蹄疫的金标准，但其确认结果至少需要7天，检测周期太长，并且这些技术普遍费用太高，存在二次散毒的隐患，一般基层很难开展此项工作。同时，O型和A型口蹄疫近年在我国流行比较普遍，而C型口蹄疫在我国周边亚洲地区具有流行史，因此建立一种快速诊断C型、O型和A型口蹄疫的诊断技术，完成对O型和A型口蹄疫的快速诊断以及对C型口蹄疫病毒进行监控，防止其传入我国具有重要意义。

发明内容

本发明提供一种快速、简便、灵敏和经济的检测试剂盒及使用方法，且这种方法用于检测临床样品时，可以区分动物所感染的是A、O和C型口蹄疫病毒。

本发明的试剂盒中至少有三对引物组成，其中的两对引物分别是：

第一对引物是用于扩增A型口蹄疫目的基因的引物，其中

上游引物：5-CAT CTA CGA GGC TGT CAA G-3

下游引物：5-TAG GGT GGA AAC CGA ACT-3

第二对引物是用于扩增C型口蹄疫目的基因的引物，其中

上游引物：5-GAA CTA CGG AGG CGA GAC G-3

下游引物：5-TGG TGC GGT GTA TGG GAG-3

第三对引物是用于扩增O型口蹄疫目的基因的引物，其中