[发明专利]梅花SSR遗传图谱的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、遗传学和基因组学领域，具体地说，涉及梅花SSR遗传图谱的构建方法。

背景技术

梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)属于蔷薇科李属，原产于我国川、滇、藏、贵等地区，已有3000多年的栽培历史，是我国重要的木本观赏花卉。但是由于缺乏大量的多态性分子标记，其遗传学和基因组学方面的研究滞后于蔷薇科其他植物。

目前在木本观赏花卉的遗传学分析中，应用较多的主要是RAPD、ISSR、AFLP等分子标记，但是这些标记大多是采用无全基因组序列信息的技术开发得到，虽然具有一定的应用价值，但是随机性强、稳定性差。而简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)标记，也称为微卫星DNA(Macrosatellite)，是一种由1-6个核苷酸为单位多次串联重复的长达几十甚至几百个核苷酸的序列。由于SSR标记具有重复性好、稳定性强、多态性高、共显性遗传和在基因组中普遍存在等优点，广泛应用于植物遗传图谱的构建、品种鉴定、遗传多样性分析、DNA指纹图谱的构建和分子标记辅助育种等研究。随着测序技术的发展和成本的降低，许多的植物均已完成全基因组测序，在此基础上便于对这些植物进行全基因组SSR标记的挖掘和分析。由于将基因组的所有SSR位点对备选材料进行逐个分析，需要耗费大量的人力和物力，所以在小麦、甘蓝、棉花和玉米等作物中采用核心引物(全基因组染色体上均匀覆盖并且多态性、稳定性、重复性等综合特征好、可作为初步研究优先选用的一套引物)进行研究，有助于提高SSR技术的检测效率。因此开发基于梅花全基因组序列的SSR核心引物组，有助于高效的构建梅花的遗传图谱，开展与重要观赏性状相关的QTL定位，从而推动梅花分子标记辅助育种的进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种梅花SSR遗传图谱的构建方法。

本发明的另一目的是提供一套基于梅花全基因组序列开发的SSR引物组。

本发明的再一目的是提供一套基于梅花全基因组序列开发的SSR核心引物组。

为了实现本发明目的，本发明的一种梅花SSR遗传图谱的构建方法，包括以下步骤：1)提取待测梅花亲本与子代的基因组DNA；2)利用生物学软件，在梅花全基因组序列中，挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记，并分别针对这些SSR标记设计SSR引物；3)分别利用上述SSR引物，各自以待测梅花亲本和子代的基因组DNA为模版，进行PCR扩增；4)利用生物学软件分析PCR扩增结果，构建出梅花SSR遗传图谱。

前述方法中，所述待测梅花亲本是以梅花品种‘粉瓣’为母本，以‘扣子玉蝶’为父本。

前述方法中，步骤2)中挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记的标准为：单核苷酸重复单元最小的重复长度为10bp，二核苷酸到四核苷酸重复单元最小的重复长度为12bp，五核苷酸重复单元最小的重复长度为15bp，六核苷酸重复单元最小的重复长度为18bp。

前述方法中，步骤2)中设计的SSR引物如序列表中所示的670对引物，优选序列表中所示的144对核心引物。

前述方法中，步骤3)中进行PCR扩增反应之前，分别用FAM、HEX和TEMRA三种荧光对序列表中所示的144对核心引物的上游引物进行荧光标记。

前述方法中，所述步骤4)为：利用生物学软件分析PCR扩增结果，利用卡平方检验作图群体符合孟德尔期望分离比为1∶2∶1、1∶1或1∶1∶1∶1的标记，P＜0.05，过滤掉SSR标记中偏分离的标记，构建出梅花SSR遗传图谱。

具体地，本发明提供的基于梅花全基因组序列开发的SSR引物及其应用的方法，其包括如下步骤：

1、构建梅花F1代拟测交群体；

2、对父母本及其190个子代进行基因组DNA的提取；

3、利用MISA软件，在梅花全基因组序列中，挖掘1-6个核苷酸重复单元的SSR标记；

4、从中随意挑选出670个含有SSR标记的核苷酸序列，利用Primer 3.0软件设计670对SSR引物(如序列表所示)；