[发明专利]分离I型前胶原氨基末端肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离I型前胶原氨基末端肽(PINP)的方法。

背景技术

PINP是一个非常灵敏的骨转化速率的指标；PINP的变化与骨密度的变化高度相关，并与抗骨吸收的疗效相关。PINP在用于检测抗骨吸收治疗的时候，在短短的几个月内对骨转化的治疗作用给予评价。相反如果通过检测病人的骨密度(BMD)来判断治疗效果，这一过程需要大约两年时间。最近的数据也表明PINP对于检测骨质疏松病人的合成代谢治疗的效果特别有效。早期通过PINP来评定骨质疏松的治疗，不仅能帮助患者选择正确的治疗方案，而且能增强患者治疗的信心。乳腺癌的发病程度与PINP的水平相关。

PINP的分子量35KD，高度磷酸化，在体内的浓度男性20-76μg/L，女性19-84μg/L。PINP最初由羊水分离，并命名为胎儿抗原2，测序表明其大部分为两条a1链形成的同聚体，少部分为2条a1和一条a2链非共价键组成的三联体结构。然而，传统方法要求用第4～6个月的胎儿羊水，使PINP的生产受到极大的限制。因此，本发明主要寻求一种更高效、更实用的PINP制备方法。

在偶然的实验中，我们用芬兰公司的I型前胶原肽免放药盒(UniQPINP RIA)随机测定了3份癌性病人的腹水，发现其PINP的含量都达到了标准品的最高值，即都大于250ng/ml。但到目前还未见从人的腹水中提取了PINP的报道。

发明内容

本发明是要解决I型前胶原氨基末端肽的提取方法、效率、纯度、活性的问题。采用硫酸氨分级分离发法，第一步去除了大部分的杂蛋白。采用等电点分离法又去除大部分的杂蛋白。Qsepharose FF，上样量大，流速快，分辩高，大大提高了效率。最后用高分辨率的Superdex200代替Sephacryl200，进一步提高纯度。经SDS-PAGE分析纯度达98％，活性和纯度非常满意。

附图说明

图1：腹水纯化前后SDS/PAGE电泳结果

图2：superdex200分子筛层析

具体实施方式

取癌性病人腹水2升，10000RPM离心，取上清。目的是去掉组织块和癌性细胞；这一步必须穿戴防护手套和眼镜，因为决大多数肝癌病人都携带肝炎病毒；

首先，我们采用硫酸铵分级沉淀法，收集硫酸铵浓度达到40～60％的馏分。方法为先加入40％硫酸铵后搅拌过夜，10000RPM离心，弃沉淀，上清继续加硫酸铵至60％，10000RPM离心，留沉淀。沉淀用Buffer A溶解、透析，每隔12小时换液，透析两天，其中BufferA的配方为：20mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH7.4；透析液的配方为：20mM Tris，1mM EDTA，50mM NaCl，pH7.4。

其次，我们根据序列分析，PINP的等电点为6.2。上述第一步透析好的样品，10000RPM离心，留上清。上清用盐酸调溶液的pH为6.2，搅拌4个小时，10000RPM离心，留沉淀；沉淀用生理盐水溶解后，用Buffer A透析过夜，取出透析好的样品，10000RPM离心，留上清。

采用柱层析法：第二步中经过Buffer A透析的样品上阴离子交换柱Q-SepharoseFF，用Buffer A和Buffer B(20mM Tris，1mM EDTA，1M NaC)进行梯度洗脱，收集40～60％Buffer B部分洗脱液；此收集物用BufferC(0.1M HAC-NaAC，pH4.4)透析，上阳离子交换柱CM-SepharoseFF，用Buffer C和Buffer A进行梯度洗脱，收集20～50％Buffer A馏分；浓缩成5mg/ml，取200μl上superdex200分子筛层析，收集35KD位置的峰，浓缩成1mg/ml，加入0.1％叠氮钠，1mM PMSF，-20℃保存即可。其中Buffer B的配方是：20mM Tris，1mM EDTA，1M NaCl；Buffer C的配方是：0.1M HAC-NaAC，pH4.4。

标记底物是放免药盒的重要组成部分，其质量对药盒至关重要。对于标记底物质量的检定，最终通过标记后对药盒的各个指标来体现的。用芬兰公司的I型前胶原肽免放药盒UniQPINP RIA(国家食品药品监督管理局特殊药品进口准许证P-04-05-27-03)检验各峰中PINP的含量，获得纯度高的PINP(见附图1、2)。通过标记物替代实验，各项指标都完全达到要求。

纯度鉴定：经多步纯化可得到95％的目的蛋白，结果见附图1、图2。图1：A：蛋白质分子量标准，B：腹水稀释1000倍，C：Q-SepharoseFF后蛋白，D：CM-SepharoseFF后蛋白，E：superdex200分子筛后蛋白。图2：superdex200分子筛层析结果，2号为目标峰。目标峰经用芬兰试剂盒检测，结果稀释1000倍后测值仍然大于250ng/ml。