[发明专利]大豆疫霉的检测靶标序列A3apro及其特异性LAMP引物组合物和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及大豆疫霉的检测靶标序列A3apro及其特异性LAMP引物组合物和应用。 

背景技术

大豆疫霉菌（Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann）侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，也是我国对外公布的一类检疫对象。大豆疫霉根腐病最早于1948年在美国印第安那州被发现^[3]，此后，加拿大、巴西、阿根廷等二十多个大豆生产国家相继报道了该病害的发生^[2，6]。苏彦纯^[10]等于1993年首次报道了我国的黑龙江大豆主产区发生大豆疫霉根腐病，此后在我国北方的大豆主产区陆续发现大豆疫霉的危害。目前每年给全球大豆生产造成的经济损失超过10亿美元^[8]。为了阻止大豆疫霉传播范围的不断扩大，使大豆疫霉根腐病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。 

传统的检测大豆疫霉的方法是进行大豆叶碟诱捕和平板培养或者将二者相结合^[1，10]。传统方法在大豆疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测大豆疫霉^[7]，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。 

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术^[4]，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。 

靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。以PCR技术检测大豆疫霉菌是基于核糖体基因序列^[7]，但由于核糖体序列没有足够多的位点来区分所有的病原菌，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种大豆疫霉的检测靶标序列A3apro。 

本发明的另一目的是提供该大豆疫霉的检测靶标序列A3apro的其特异性LAMP引物组合物。 

本发明的又一目的是提供该大豆疫霉的检测靶标序列A3apro及其LAMP引物组合物的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

大豆疫霉的检测靶标序列A3apro，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述的大豆疫霉的检测靶标序列A3apro在检测或鉴定大豆疫霉中的应用。 

针对所述的大豆疫霉的检测靶标序列A3apro设计的特异性的LAMP引物组合物，分别为：正向内引物FIP：SEQ ID NO.2，反向内引物BIP：SEQ ID NO.3，正向外引物F3：SEQ ID NO.4，反向外引物B3：SEQ ID NO.5。 

所述的针对所述的大豆疫霉的检测靶标序列A3apro设计的特异性的LAMP引物组合物在检测或鉴定大豆疫霉中的应用。 

一种用于检测大豆疫霉的LAMP检测试剂盒，包含所述的特异性的LAMP引物组合物。 

所述的用于检测大豆疫霉的LAMP检测试剂盒，包含：由1.6μM正向内引物FIP、1.6μM反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3、1.4mM dNTPs、20mM pH 8.8的Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH4)₂SO4、6mM MgSO₄、0.1％Triton X-100、8U Bst DNApolymerase 320单位、180mM羟基萘酚蓝，加入超纯水制备成检测溶液。